唑來膦酸對鈦微粒誘導(dǎo)的破骨細胞前體細胞RAW 264.7分化的影響

張怡元 林煜 肖莉莉 王武煉 馮爾宥

【摘 要】目的：觀察唑來膦酸對鈦微粒誘導(dǎo)的破骨細胞前體細胞RAW 264.7分化的影響，探討其防治假體周圍骨質(zhì)疏松的可能性。方法：體外培養(yǎng)單核巨噬細胞白血病細胞RAW 264.7。制備鈦微粒，MTT法檢測繪制RAW 264.7細胞增殖曲線，尋找唑來膦酸最佳干預(yù)濃度。將RAW 264.7分為3組：Ti微粒組（0.1%體積比鈦微粒+含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清培養(yǎng)基）、Ti+唑來膦酸組（0.1%體積比鈦微粒+含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清培養(yǎng)基+最佳濃度唑來膦酸）和對照組（含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的常規(guī)培養(yǎng)基）。采用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色法觀察細胞的形態(tài)。采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中細胞核因子κB活化因子受體（receptor activator of NF-κB，RANK）的濃度，生化法測定細胞上清液中TRAP活力，用qPCR法檢測TRAP、基質(zhì)外金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydraseⅡ，CAⅡ）、磷酸酶-活化T細胞核因子（NFATcl） mRNA的表達；Western Blot法檢測TRAP、RANK、CtsK蛋白的表達。結(jié)果：鈦微粒能刺激RAW 264.7分泌促破骨細胞分化的因子，并能促進單核細胞向破骨細胞轉(zhuǎn)化。唑來膦酸可明顯下調(diào)鈦微粒誘導(dǎo)的RAW 264.7 RANK的表達，以及TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl mRNA和蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：唑來膦酸能有效抑制破骨細胞前體細胞RAW 264.7分化，減少破骨細胞的形成，下調(diào)RANK、TRAP等破骨細胞特異細胞表型和功能基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，有望成為防治人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍骨質(zhì)疏松的藥物。

【關(guān)鍵詞】 唑來膦酸；鈦微粒；RAW 264.7；共培養(yǎng)分化

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.03.001

Effect of Zoledronic Acid on the Differentiation of Titanium Particle Induced Osteoclast Precursor

Cells RAW 264.7

ZHANG Yi-yuan，LIN Yu，XIAO Li-li，WANG Wu-lian，F(xiàn)ENG Er-you

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of zoledronic acid on the differentiation of titanium particle-induced osteoclast precursor cells RAW 264.7 to probe its possibility in the prevention and treatment of osteoporosis around prosthesis.Methods：RAW 264.7 cells were cultured in vitro.A preparation of titanium particles was made and the MTT method was used to detect the growth curve of RAW 264.7 cells in order to look for the best concentration of zoledronic acid for intervention.Cells Raw 264.7 was divided into three groups：the Ti particles group （0.1% volume ratio of titanium particles + 10% fetal bovine serum culture medium），the Ti+ zoledronic acid group （0.1% volume ratio of titanium particles + 10% fetal bovine serum culture medium + optimal concentration of zoledronic acid） and the control group （10% fetal bovine serum culture medium）.The tartrate resistant acid phosphatase （TRAP） staining was used to observe the morphology of cells.The ELISA method was used to detect the concentration of RANK （receptor activator of NF-κB）.The biochemical method was used to determine the activity of TRAP in the supernatant of cells.The qPCR method was used for the detection of the expressions of TRAP，matrix metalloproteinase 9 （MMP-9），carbonic anhydraseⅡ（CAⅡ） and （NFATcl） mRNA；Western Blot was used to detect the expressions of TRAP，RANK，CtsK and proteins.Results：Titanium particles could stimulate RAW 264.7 to secrete osteoclast differentiation factors and promote the transformation of mononuclear cells to osteoclasts.Zoledronic acid could obviously make a down regulation for the expression of titanium particle-induced RAW 264.7 RANK and the expressions of TRAP，MMP-9，CAⅡ，NFATcl mRNA and proteins.The difference was statistically significant （P < 0.05）.Conclusion：Zoledronic acid can effectively inhibit the differentiation osteoclast precursor cells RAW 264.7，reduce the formation of osteoclast and make a down regulation of the phenotype of osteoclast and the transcription level of functional gene mRNA，which is expected to become a drug for the prevention and treatment of postoperative periprosthetic osteoporosis.

【Keywords】 zoledronic acid；titanium particle；RAW 264.7；co-culture and differentiation

隨著我國人口的老齡化，由于外傷、股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松導(dǎo)致髖部骨折的患者不斷增加，而人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)（total hip arthroplasty，THA）已經(jīng)成為恢復(fù)髖部功能的主要方式[1]。目前，影響髖關(guān)節(jié)穩(wěn)定性、假體使用壽命及增加翻修率的主要原因是THA術(shù)后假體周圍骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的假體無菌性松動[2]。研究表明，置換后的金屬與聚乙烯襯墊因持續(xù)磨損而產(chǎn)生大量的含有金屬的微粒與亞微粒，脫落的微粒會隨著機械微動遷移至骨-假體界面，這些磨損微粒能通過促進破骨細胞分化和骨吸收活性從而引起假體周圍骨質(zhì)疏松[3-4]。唑來膦酸（zoledronate，ZOL）是目前治療骨質(zhì)疏松的雙膦酸鹽類代表藥物，主要通過抑制破骨細胞分化、降低骨重建發(fā)揮作用[5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，ZOL能通過抑制假體周圍破骨細胞的分化、減緩骨重建的速度增加假體周圍骨質(zhì)量[6]。因此，本實驗擬通過研究ZOL干預(yù)鈦微粒誘導(dǎo)的破骨細胞前體細胞

RAW 264.7，觀察其對RAW 264.7分化的影響，以期為臨床采用ZOL預(yù)防THA術(shù)后因假體周圍骨質(zhì)疏松而引起的無菌性松動提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物和細胞 ZOL由北京諾華制藥有限公司提供[規(guī)格5 mg·（100 mL）-1，進口藥品注冊證號H20070127]；RAW 264.7采購自廣州吉尼歐生物科技有限公司（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）。

1.2 主要試劑和檢測儀器 直徑平均為（0.91±

0.65）μm鈦微粒（北京有色金屬公司）；Trizol（invitrogen公司）；RANK ELISA檢測試劑盒（西唐公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PCR引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)技術(shù)有限公司）；CtsK、RANK、TRAP、β-actin抗體（Cell Signaling公司）；PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM PCR Kit（TAKARA公司）；9600型PCR擴增儀（美國PE公司）；7500 Fast實時定量PCR儀（美國ABI公司）；ELx800酶標儀（BIO-TEK公司）。

2 方 法

2.1 干預(yù)前鈦微粒的預(yù)處理 首先將鈦微粒置于烤箱，300 ℃6 h，將100 mg鈦微粒懸浮于

25 mL質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇中制成混懸液。放在200 r·min-1水平搖床，24 h后離心去上清液。更換乙醇繼續(xù)振蕩24 h，離心去液體，PBS洗滌3次。再次干燥后，置于紫外線中照射24 h。檢測處理后的鈦微粒內(nèi)毒素質(zhì)量分數(shù) < 0.10 EU·mL-1，可以排除內(nèi)毒素對細胞的影響。最后預(yù)處理后的鈦微粒置于DPBS中，配制成體積比為0.1%的混懸液即每毫升0.1%（v/v）的混懸液終含鈦微粒4.5×107。在干預(yù)前須用超聲磁力震蕩器震蕩10 min消除粘連。

2.2 ZOL干預(yù) 將RAW 264.7以1×106個每孔密度接種于6孔板，將其放入培養(yǎng)箱過夜。分為

3組：Ti微粒組（0.1%體積比鈦微粒+含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清培養(yǎng)基）、Ti+唑來膦酸組（0.1%體積比鈦微粒+含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清培養(yǎng)基+最佳濃度唑來膦酸）和對照組（含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的常規(guī)培養(yǎng)基）。干預(yù)后連續(xù)培養(yǎng)48 h。同時采用TRAP染色，觀察是否分化為破骨細胞。

2.3 ZOL對RAW 264.7增殖的影響 將RAW 264.7

細胞以104·mL-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，過夜后棄去舊培養(yǎng)液，分別加入含0，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4，10-3，10-2，10-1 mol·L-1的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)8孔，培養(yǎng)72 h，加入四唑鹽液（5 g·L-1）20 μL每孔，37 ℃孵育4 h后吸去上清液，加入DMSO液體150 μL每孔，在搖床上振蕩10 min，用酶標儀選擇490 nm波長測定各孔吸光度值（A），其值與細胞數(shù)量成正比。比較不同ZOL對RAW 264.7增殖的影響，并找出最佳的干預(yù)RAW 264.7的濃度。

2.4 ELISA法檢測培養(yǎng)液RANK濃度 取干預(yù)48 h

后離心，分別取細胞與培養(yǎng)液，細胞用TX-1000

裂解后，按照試劑盒說明書，在待測96孔板中分別加入樣品、標準品、空白液各100 μL，加樣后，置于溫箱37 ℃30 min，洗板并加入酶標偶合液100 μL，37 ℃20 min。洗板后加入底物、終止液50 μL，與酶標儀上長讀取OD值。樣本均設(shè)復(fù)孔。

2.5 生化法檢測細胞液TRAP濃度 取干預(yù)48 h后培養(yǎng)液加入試管，每管0.05 mL，將蒸餾水0.05 mL、

0.1 mg·mL-1酚標準應(yīng)用液0.05 mL加入空試管中，再加入緩沖液、基質(zhì)液各0.5 mL充分混勻，37 ℃水浴15 min，最后加入1.5 mL顯色劑，立即混勻，520 nm，0.5 cm光徑比色，空白管調(diào)零，測各管

吸光度。

2.6 qPCR法檢測TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl

mRNA表達 見表1。

采用Trizol法提取細胞總RNA，計算出抽提后的RNA濃度，取500 ng提取后的RNA，按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)復(fù)孔在7500 Fast實時定量PCR儀上按進行cDNA擴增，得到擴增曲線、CT值、溶解曲線，每個指標每個樣本均設(shè)3個復(fù)孔。使用7500 system SDS 軟件將得到的CT值換算成最終數(shù)據(jù)。

2.7 Western Blot法檢測細胞中RANK、MMP-9、

NFATcl蛋白的表達 提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，以每泳道上樣30 μg蛋白，質(zhì)量分數(shù)為12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。在室溫下封閉30 min，加入一抗封1 h。每次40 mL洗液漂洗膜6次，即：1 min 2次，20 min 2次，5 min 2次。然后將二抗室溫封閉30 min，洗膜5次。AP化學(xué)發(fā)光底物與膜在室溫下孵育反應(yīng)5 min，壓片曝光、顯影。采用Phoretix 1D生物電泳圖像分析系統(tǒng)分析膠片中蛋白的條帶，計算機自動讀取并記錄每條帶的光密度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，首先比較樣本是否呈正態(tài)分布，并檢驗方差齊性，多組之間比較先采用F檢驗，而后進行q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 ZOL干預(yù)后RAW 264.7細胞形態(tài) 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與鈦微粒共培養(yǎng)后部分RAW 264.7細胞核增多，偽足增多，細胞間排列不齊，有偽足。干預(yù)后的細胞采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色，發(fā)現(xiàn)細胞的胞漿部位形成棕紅色沉淀，細胞核染色成陰性。其中Ti微粒組最為明顯，Ti+ZOL組次之，對照組無明顯改變。見圖1。

3.2 ZOL促RAW 264.7細胞增殖情況 MTT法檢測后繪制RAW 264.7細胞增殖曲線圖發(fā)現(xiàn)，細胞在ZOL濃度為0～10-6 mol·L-1之間無明顯變化，之后隨著濃度增加細胞增殖能力逐漸降低。因此確定濃度為10-6 mol·L-1 ZOL為干預(yù)最佳濃度。

3.3 各組RAW 264.7細胞中RANK、TRAP表達 Ti微粒組中RANK、TRAP表達最高，Ti+ZOL組次之，對照組最低，兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3.4 各組RAW 264.7細胞中TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl基因表達 qPCR結(jié)果表明，Ti微粒組及Ti+ZOL組的TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl的RNA表達均高于未含鈦顆粒的正常組，且Ti微粒組的TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl表達高于Ti+ZOL組，各組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

3.5 各組RAW 264.7細胞中RANK、MMP-9、NFATcl蛋白表達 各組RANK、MMP-9、NFATcl蛋白表達量情況以Ti微粒組的蛋白表達含量最高，Ti+ZOL組次之，對照組最低。各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

4 討 論

THA是治療晚期髖關(guān)節(jié)疾病的理想方法。目前，影響假體長期生存率的原因主要是假體松動，假體周圍骨量的丟失與松動具有顯著的關(guān)系[7-8]。THA假體植入后假體周圍磨損顆粒激活循環(huán)血單核細胞并將其募集至假體周圍，破骨細胞前體細胞也聚集在異物單核細胞群周圍，引發(fā)破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化，因此，破骨細胞前體細胞在假體周圍骨質(zhì)疏松中扮演重要角色。雖然手術(shù)技術(shù)、假體材料及制作工藝較之前有明顯的改善，但是假體上磨屑顆粒的產(chǎn)生卻是無法避免的。要解決假體周圍骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的假體松動，除了改進假體材料與制作工藝以盡量減少磨屑顆粒產(chǎn)生和提高手術(shù)技術(shù)外，如何抑制因磨屑顆粒導(dǎo)致破骨細胞的活化，實現(xiàn)延長假體使用壽命，減少關(guān)節(jié)翻修率就顯得尤為重要。

TRAP主要存在于巨噬細胞、破骨細胞、單核吞噬細胞等細胞中，是破骨細胞重要的酶組化識別標志[9]。MMP-9在破骨細胞中特異性高表達，可特異性地降解非礦化的軟骨和釋放細胞外基質(zhì)結(jié)合的血管內(nèi)皮生長因子，發(fā)揮其直接趨化、活化破骨細胞的作用，同時還在破骨細胞遷移過程中發(fā)揮重要的作用，是破骨細胞移動到骨表面的關(guān)鍵因素[10]。RANK則位于破骨前體細胞上，能被RANKL識別，RANKL與破骨細胞受體結(jié)合后，誘導(dǎo)破骨細胞的形成和活化[11]。NFATcl是RANKL介導(dǎo)的破骨細胞分化過程中最重要的因子，能活化RANKL/RANK途徑的下游，促進破骨細胞前體細胞RAW 264.7向破骨細胞分化，并誘導(dǎo)破骨細胞的各種特異性基因的表達，如TRAP、CAⅡ等[12]。本研究結(jié)果顯示，與鈦微粒共培養(yǎng)后，RAW 264.7中RANK、TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl的表達較對照組有顯著性提高（P < 0.05），提示鈦微粒能促進單核細胞向破骨細胞轉(zhuǎn)化。

ZOL是雙膦酸鹽類中最新一代的制劑，通過其含氮雜環(huán)能與骨骼緊密結(jié)合來抑制假體磨屑顆粒引起的破骨細胞功能活化帶來的骨溶解，從而達到改善假體的生物學(xué)固定效果[13]。研究表明，ZOL能抑制THA術(shù)后假體無菌性松動狗模型的假體周圍骨溶解，并且提高假體周圍的骨密度，從而改善皮質(zhì)骨生物力學(xué)性能，并且還能保護膜內(nèi)成骨；同時ZOL還可以顯著提高植入的帶有生物型羥基磷灰石涂層假體周圍骨的骨密度及生物力學(xué)參數(shù)[14-15]。此外，ZOL還能抑制整合素αv、β3在破骨細胞中基因的表達，從而影響破骨細胞在黏附、細胞骨架重排以及骨吸收中的作用[16]。本實驗在采用ZOL干預(yù)后，干預(yù)組與鈦微粒組比較，RAW 264.7細胞和細胞液中RANK的表達，TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl mRNA和蛋白的表達均明顯下降（P < 0.05）。表明ZOL可能是通過RANKL/RANK途徑，阻滯RANK受體的結(jié)合，抑制NFATcl的表達，并下調(diào)RAW 264.7細胞中TRAP、MMP-9的表達，最終抑制破骨細胞的分化成熟，從而降低破骨細胞的骨吸收功能。

總之，本研究采用ZOL對鈦微粒誘導(dǎo)的破骨細胞前體細胞RAW 264.7干預(yù)，發(fā)現(xiàn)ZOL能抑制RAW 264.7向破骨細胞分化；但ZOL對關(guān)節(jié)假體周圍骨吸收的長期作用到底如何，且對假體上磨屑顆粒的產(chǎn)生炎癥因子是否有抑制作用，均有待于進一步研究。

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收稿日期：2015-10-29；修回日期：2016-01-12