桑粉虱快速分子檢測(cè)技術(shù)

柴建萍+倪婧+江秀均+羅雁婕+謝道燕+白興榮

摘要： 桑粉虱[Pealius mori （Takahashi）]是我國(guó)植桑區(qū)重要的桑樹(shù)害蟲(chóng)，在云南植桑區(qū)引起危害。針對(duì)桑粉虱蟲(chóng)體小，與其他種類(lèi)粉虱形態(tài)相似導(dǎo)致識(shí)別困難的問(wèn)題，基于線粒體COⅠ分子標(biāo)記進(jìn)行桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定的工作，比較與桑粉虱親緣關(guān)系較近的6種粉虱COⅠ基因序列，設(shè)計(jì)桑粉虱種特異性引物sfs5-1/sfs5-2，擴(kuò)增300 bp片段，建立桑粉虱快速分子檢測(cè)技術(shù)。該引物只對(duì)桑粉虱COⅠ基因具有擴(kuò)增能力，而對(duì)煙粉虱、溫室白粉虱無(wú)擴(kuò)增效果，且對(duì)桑粉虱單頭成蟲(chóng)、卵粒、幼蟲(chóng)具有較好擴(kuò)增能力，表現(xiàn)出桑粉虱種的特異性。該引物靈敏性高，對(duì)桑粉虱DNA模板最低檢測(cè)值為0.15 ng/μL。該檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)便、高效，可用于桑粉虱鑒定、苗木調(diào)運(yùn)過(guò)程害蟲(chóng)檢測(cè)、種群遷移擴(kuò)散監(jiān)測(cè)及防控機(jī)制研究等多個(gè)領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞： 桑粉虱；COⅠ基因；特異性引物；分子檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S433.39 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0145-03

桑粉虱[Pealius mori（Takahashi）]屬同翅目粉虱科害蟲(chóng)，是對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在較大威脅的6種重要粉虱類(lèi)害蟲(chóng)之一[1]。桑粉虱以幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)刺吸桑葉汁液發(fā)生危害，其分泌物導(dǎo)致桑園煤污病流行，造成桑葉品質(zhì)及產(chǎn)量下降。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)植桑區(qū)域呈現(xiàn)“東桑西移”格局，桑粉虱在云南植桑區(qū)暴發(fā)危害并呈擴(kuò)大趨勢(shì)。由于各地對(duì)桑粉虱種類(lèi)識(shí)別不清楚，缺乏靶標(biāo)害蟲(chóng)發(fā)生規(guī)律、危害習(xí)性、藥劑防效等背景知識(shí)，導(dǎo)致防治效果低下、防控難度增大。

粉虱類(lèi)害蟲(chóng)的形體微小，種內(nèi)變異普遍，僅憑粉虱成蟲(chóng)的外觀識(shí)別易造成種類(lèi)鑒定混亂[2]。粉虱分類(lèi)鑒定依據(jù)蛹?xì)ぬ卣鞫浅上x(chóng)特征[3]，蛹?xì)ば螤詈皖伾趁嫣卣?，邊緣的齒和剛毛，背剛毛和刺毛，胸部和腹部氣管褶、孔、冠、裂等特征是粉虱分類(lèi)的重要依據(jù)[4]。桑粉虱蛹體長(zhǎng)0.70～0.80 mm，呈黃褐色，橢圓形；成蟲(chóng)體長(zhǎng)0.70～0.80 mm，體淡黃色，被有白粉[5]，外形與其他種類(lèi)粉虱極為相似。非專(zhuān)業(yè)研究人員很難直觀地將桑粉虱與其他種類(lèi)粉虱區(qū)別開(kāi)。應(yīng)用DNA序列的分子標(biāo)記技術(shù)可找出不同生物類(lèi)群間的遺傳差異，彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)方法的不足，能較快進(jìn)行物種鑒定[6]。其中線粒體COⅠ基因被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育及近緣種鑒定，在煙粉虱隱種鑒定、遺傳分化研究中發(fā)揮重要作用。但在昆蟲(chóng)種類(lèi)鑒定時(shí)，線粒體COⅠ基因需經(jīng)PCR擴(kuò)增、檢測(cè)、測(cè)序、比對(duì)等諸多環(huán)節(jié)，操作過(guò)程耗時(shí)、費(fèi)用高，特別在進(jìn)行大量樣本鑒定時(shí)較為繁瑣。

本研究基于線粒體COⅠ分子標(biāo)記對(duì)桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定的結(jié)果，即桑樹(shù)上只有桑粉虱1種粉虱類(lèi)害蟲(chóng)危害，而桑園周邊蔬菜及經(jīng)濟(jì)作物以煙粉虱B型、溫室白粉虱發(fā)生危害[7]。比較桑粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱、螺旋粉虱、番荔枝褶粉虱、番石榴黑棒粉虱、伯粉虱等7種粉虱COⅠ基因序列，根據(jù)桑粉虱COⅠ基因的種間特異性設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)，建立桑粉虱快速分子檢測(cè)技術(shù)，以期為植桑區(qū)桑粉虱害蟲(chóng)識(shí)別、危害監(jiān)測(cè)及種群發(fā)生機(jī)制研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲(chóng)源

桑粉虱采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所桑園（2014年6月），蟲(chóng)態(tài)為成蟲(chóng)、卵、幼蟲(chóng)。煙粉虱樣本采自桑園周邊寄主植物薄荷（2012年5月），蟲(chóng)態(tài)為成蟲(chóng)。溫室粉虱采自大棚內(nèi)寄主植物黃瓜（2012年5月），蟲(chóng)態(tài)為成蟲(chóng)。煙粉虱及溫室粉虱經(jīng)過(guò)線粒體mt COⅠ分子標(biāo)記鑒定為煙粉虱B型及溫室白粉虱[7]。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

XW-80A渦旋儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；Sorva ll Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（ThermoFish）；S1000 PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD）；PowerPac Universal電泳系統(tǒng)（BIO-RAD）；GelDoc TM+XR紫外凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）。

DNA提取液：含50 mmol/L Tris-HCl （pH 值8.0）、20 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1% SDS；Tris-EDTA緩沖液：含10 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 值8.0）；蛋白酶K（Merck）、Easy Taq DNA Polymerase、2.5 mmol/L dNTPs，購(gòu)自Trans（北京）公司；引物由Invitrogen（上海）公司合成；其他無(wú)機(jī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 供試粉虱DNA提取

粉虱DNA提取方法參照柴建萍等方法[7]，分別提取5頭桑粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱基因組DNA。收集桑粉虱5個(gè)粒卵及5頭2齡幼蟲(chóng)，進(jìn)行桑粉虱卵、幼蟲(chóng)基因提取。

1.4 桑粉虱特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)柴建萍等報(bào)道的桑粉虱（登錄號(hào)：KP168713）測(cè)序結(jié)果[7]，以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)的煙粉虱（Bemisia tabaci）（登錄號(hào)：KF059959）、溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）（登錄號(hào)：HM185763）、螺旋粉虱（Aleurodicus dispersus）（登錄號(hào)：KC822648）、番荔枝褶粉虱（Aleurotrachelus anonae） （登錄號(hào)：HM150624）、番石榴黑棒粉虱（Aleuroclava guyavae）（登錄號(hào)：JQ340179）、伯粉虱待定種（Metabemisia sp.）（登錄號(hào)：JQ340198）7種粉虱COⅠ堿基序列，應(yīng)用CLUSTAL X 2.1、MEGA5軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析；用Primer Premer 5.0軟件設(shè)計(jì)桑粉虱特異性引物并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5 引物特異性驗(yàn)證

分別以鑒定為桑粉虱、煙粉虱B型、溫室白粉虱的各5頭成蟲(chóng)的DNA為模板，用設(shè)計(jì)引物sfs5-1/sfs5-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物特異性。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中含 2.5 μL 10×buffer，1.9 μL 2.5 μmol/L dNTPs，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，0.2 μL 5 U/L Taq DNA聚合酶，1.8 μL 100 μg/mL DNA模板，加ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μ L 擴(kuò)增產(chǎn)物，加1 μL載樣緩沖液于1%瓊脂糖凝膠中，在100 V電壓下電泳15 min后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)電泳結(jié)果。

1.6 引物靈敏性檢測(cè)

以桑粉虱5頭幼蟲(chóng)、5粒卵提取的基因組DNA為模版，用引物sfs5-1/sfs5-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)有效性；檢測(cè)桑粉虱DNA模板濃度，并將模板濃度按1、10、102、103、104倍數(shù)稀釋成系列濃度梯度，用引物sfs5-1/sfs5-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)其靈敏性。PCR體系及反應(yīng)條件同“1.5”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的選擇

通過(guò)桑粉虱與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的共7種粉虱COⅠ基因序列對(duì)比分析，設(shè)計(jì)桑粉虱特異性引物sfs5-1/sfs5-2，上游引物sfs5-1為5′-GTGGATTTGGGAACTGACTA-3′，下游引物sfs5-2為5′-GTGACATTCCTAAGGTTCGT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為300 bp。

2.2 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

選擇引物sfs5-1/sfs5-2對(duì)桑粉虱及桑園周邊煙粉虱B型、溫室白粉虱基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果表明，桑粉虱基因組DNA均可擴(kuò)增出約300 bp目的條帶，而煙粉虱及溫室白粉虱基因組DNA未見(jiàn)目的條帶（圖1）。3種粉虱各重復(fù)5頭成蟲(chóng)基因組擴(kuò)增得到的結(jié)果一致，說(shuō)明引物sfs5-1/sfs5-2在3種粉虱中具有桑粉虱種的特異性。

2.3 引物靈敏性檢測(cè)

引物sfs5-1/sfs5-2對(duì)桑粉虱幼蟲(chóng)及卵基因組均可擴(kuò)增出約300 bp目的條帶，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)桑粉虱卵、幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)各蟲(chóng)態(tài)具有良好擴(kuò)增能力（圖2）。桑粉虱DNA模板按1、10、102、103、104倍數(shù)稀釋后分別得到1.5 ng/μL、0.15 ng/μL、15 pg/μL、1.5 pg/μL、0.15 pg/μL系列梯度濃度，經(jīng)過(guò)引物sfs5-1/sfs5-2 的PCR擴(kuò)增、靈敏度檢測(cè)，表明該引物對(duì)模板濃度的最低檢測(cè)值為 0.15 ng/μL，引物靈敏性較高（圖3）。

3 結(jié)論與討論

對(duì)于形態(tài)特征不穩(wěn)定或多變異性的昆蟲(chóng)，特別是近緣種的區(qū)別和疑難種的鑒定，PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記技術(shù)可解決傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)難以解決的難題且不受蟲(chóng)態(tài)影響[6，8]。其中線粒體COⅠ基因已廣泛用于近緣種間系統(tǒng)進(jìn)化研究，并已應(yīng)用于粉虱、蚜蟲(chóng)等多種昆蟲(chóng)新物種鑒定[9-11]。基于線粒體COⅠ

基因序列分析基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的種特異性鑒定技術(shù)，在擴(kuò)增未知DNA模板時(shí)可根據(jù)目標(biāo)片段的有無(wú)將目標(biāo)種類(lèi)與其他種類(lèi)鑒別開(kāi)，由于該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，在粉蚧、實(shí)蠅、小蠹蟲(chóng)、線蟲(chóng)等害蟲(chóng)的快速鑒定中被廣泛應(yīng)用[12-15]。針對(duì)較多隱種分化的煙粉虱，通過(guò)對(duì)多個(gè)隱種mtCOⅠ序列限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)分析，篩選特定的內(nèi)切酶，利用mtCOⅠPCR-RFLP技術(shù)成功鑒定了國(guó)內(nèi)9個(gè)煙粉虱隱種[16]。應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)篩選出溫室白粉虱特異性片段，由此片段設(shè)計(jì)特定序列擴(kuò)增（sequence characterized amplified regions，SCAR）特異引物可將溫室白粉虱與其他種粉虱區(qū)別開(kāi)，提高了溫室白粉虱檢測(cè)效率[17]。對(duì)于入侵性螺旋粉虱、雙鉤巢粉虱，采用其mtCOⅠ基因種的特異性序列，設(shè)計(jì)各自特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增、檢測(cè)，成功將靶標(biāo)粉虱與其他種粉虱區(qū)別開(kāi)，為口岸檢疫、害蟲(chóng)檢測(cè)及監(jiān)測(cè)提供了快速分子鑒定技術(shù)[18-19]。

云南蒙自桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定表明，桑樹(shù)上僅有桑粉虱1種粉虱害蟲(chóng)危害；遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育聚類(lèi)分析得出，不同于煙粉虱、溫室白粉虱等多種粉虱，桑粉虱作為獨(dú)立分枝存在[7]。東桑西移，伴隨云南省桑園面積擴(kuò)大，桑粉虱在該省的危害日趨嚴(yán)重。建立科學(xué)、簡(jiǎn)便、高效的桑粉虱檢測(cè)技術(shù)，對(duì)粉虱危害季節(jié)的桑粉虱鑒定、種苗調(diào)運(yùn)過(guò)程害蟲(chóng)檢測(cè)、種群遷移擴(kuò)散監(jiān)測(cè)及防控機(jī)制研究等有重要的科學(xué)意義。

本研究根據(jù)與桑粉虱親緣關(guān)系較近的6種粉虱mt COⅠ堿基序列，設(shè)計(jì)桑粉虱特異性引物sfs5-1/sfs5-2，并建立桑粉虱快速分子檢測(cè)技術(shù)。該引物可將桑粉虱與桑園周邊多發(fā)性的煙粉虱、溫室白粉虱區(qū)別開(kāi)，并且對(duì)桑粉虱單頭成蟲(chóng)、卵粒、幼蟲(chóng)均具擴(kuò)增能力，產(chǎn)生目的片段約為300 bp。引物靈敏度高，桑粉虱基因組DNA模板最低檢測(cè)值為0.15 ng/μL，可用于痕量或可疑蟲(chóng)態(tài)的桑粉虱檢測(cè)。煙粉虱、溫室白粉虱是世界性害蟲(chóng)。螺旋粉虱是1種入侵性害蟲(chóng)，我國(guó)臺(tái)灣有64科144種植物受害，海南省有47科120種植物受害[20]。番荔枝褶粉虱、番石榴黑棒粉虱、伯粉虱在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)檢測(cè)樣本種類(lèi)有限，僅涉及桑粉虱及廣泛分布危害的煙粉虱、溫室白粉虱，桑粉虱種特異檢測(cè)還需更多地域、更多種類(lèi)粉虱樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

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