花椰菜總黃酮提取工藝優(yōu)化

尹鵬 郭新 梁梓 胡霞

摘要：【目的】?jī)?yōu)化花椰菜總黃酮提取工藝，為其藥用開(kāi)發(fā)與利用提供技術(shù)參考?！痉椒ā恳砸掖紴榻崛軇?、花椰菜總黃酮含量為考察指標(biāo)，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)因素各篩選4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以優(yōu)化花椰菜總黃酮提取工藝?！窘Y(jié)果】影響花椰菜總黃酮提取效果的主次因素排序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫度>液料比；花椰菜總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比50∶1、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2.0 h，此條件下提取獲得花椰菜總黃酮含量為0.932 mg/g?！窘Y(jié)論】正交試驗(yàn)優(yōu)選的乙醇浸提工藝操作簡(jiǎn)便、合理可行，是提取花椰菜總黃酮的有效方法。

關(guān)鍵詞： 花椰菜；總黃酮；正交試驗(yàn)；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）04-0640-05

0 引言

【研究意義】黃酮類化合物具有多種藥理作用，可有效清除人體內(nèi)自由基、改善血液循環(huán)、降低膽固醇，已廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療（尉芹等，2001；劉品華等，2014）?；ㄒ耍˙rassica oleracea L. var. botrytis L.）隸屬十字花科（Brassicaceae）蕓薹屬（Brassica），為一年生植物，富含黃酮。但目前有關(guān)其黃酮提取工藝的研究較少，且獲得的提取率較低，因此，優(yōu)化花椰菜總黃酮提取工藝，對(duì)其藥用開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對(duì)于結(jié)構(gòu)和來(lái)源不同的黃酮類化合物，一般以其極性和水溶性大小為基礎(chǔ)選擇合適的溶劑和方法進(jìn)行提取，主要采用有機(jī)溶劑萃取、熱水提取、超聲波提取、堿性稀醇或堿性水提取、酶解提取、微波輔助萃取等（李睿等，2009；馮宗帥等，2009；楊海榮和田建林，2009；公衍玲等，2010；戴余軍等，2010）。長(zhǎng)期以來(lái)，黃酮提取工藝的研究主要集中在藥用植物方面。近年來(lái)，蔬菜黃酮的提取逐漸受到重視，如周寶利等（2012）對(duì)茄子黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間80 min，料液比1∶20，在此條件下提取率為2.2%；陳建福和施偉梅（2014）利用纖維素酶輔助法優(yōu)化西蘭花總黃酮提取工藝，在最佳工藝條件下得到西蘭花總黃酮提取率為1.251%，較傳統(tǒng)提取方法的提取率提高了41%；張翔宇等（2015）采用超聲波協(xié)同酶法提取芹菜中總黃酮，提取率為1.0184%。此外，對(duì)于南瓜總黃酮的研究相對(duì)較系統(tǒng)，南瓜花、苗、瓤、葉、莖中總黃酮提取條件的優(yōu)化均有相關(guān)報(bào)道（王小華等，2008；張欣和曾光銀，2010；周志娥等，2011；李南薇等，2011）；也有絲瓜葉（杜敏華和張彩瑩，2007）、大白菜球葉（李娟等，2007）、馬鈴薯皮（王利珍等，2011）、辣椒葉（王艷麗等，2013）總黃酮提取方面的報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)花椰菜總黃酮提取工藝方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化花椰菜總黃酮提取工藝，為花椰菜藥用開(kāi)發(fā)與利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

花椰菜（金田1號(hào)，成都金田種業(yè)有限責(zé)任公司）鮮品洗凈后烘干，搗碎，過(guò)50目篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。主要儀器設(shè)備：BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、GZX-GF-101-2-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、SHA-B水浴恒溫振蕩器（金壇市儀器廠）、A-88組織搗碎機(jī)（金壇市儀器廠）、TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、T6新悅可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照梁梓等（2012）、尹鵬等（2015）的方法，以總黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 3 花椰菜總黃酮含量測(cè)定

稱取花椰菜樣品，在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間下浸提總黃酮，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花椰菜總黃酮含量（梁梓等，2012；尹鵬等，2015）。

1. 4 單因素試驗(yàn)

1. 4. 1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花椰菜總黃酮的提取效果 稱取6份1.0 g花椰菜樣品，分別加入40 mL 40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇，于50 ℃水浴加熱1.5 h后，4000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)吸光值。

1. 4. 2 液料比對(duì)花椰菜總黃酮的提取效果 稱取6份1.0 g花椰菜樣品，按液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1和80∶1分別加入50%乙醇，于50 ℃水浴加熱1.5 h后，4000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)吸光值。

1. 4. 3 提取溫度對(duì)花椰菜總黃酮的提取效果 稱取6份1.0 g花椰菜樣品，加入40 mL 50%乙醇，分別于30、40、50、60、70和80 ℃水浴加熱1.5 h，4000 r/min離心15 min后，取上清液測(cè)吸光值。

1. 4. 4 提取時(shí)間對(duì)花椰菜總黃酮的提取效果 稱取6份1.0 g花椰菜樣品，加入40 mL 50%乙醇，于50 ℃水浴分別加熱0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，取出后4000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)吸光值。

1. 5 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)花椰菜總黃酮含量提取有意義的因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件（宋利華等，2012）。因素水平見(jiàn)表1。

1. 6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選出的提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)，測(cè)定花椰菜總黃酮含量。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

分別采用Office 2007和SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為：y=16.504x+0.0063（R2=0.9994），總黃酮質(zhì)量濃度在0～0.06 mg/mL范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系。

2. 2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花椰菜總黃酮提取效果的影響 由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，花椰菜總黃酮含量緩慢增加，但超過(guò)80%后，總黃酮含量反而降低；乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，花椰菜總黃酮含量顯著高于其他水平（P<0.05，下同）。因此，選擇60%、70%、80%和90% 4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 2. 2 液料比對(duì)花椰菜總黃酮提取效果的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，花椰菜總黃酮含量不斷增加，液料比超過(guò)40∶1后，隨著液料比的繼續(xù)增加，總黃酮含量卻不斷降低，最后逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)；液料比為40∶1時(shí)，花椰菜總黃酮含量顯著高于除50∶1之外的其他4個(gè)水平。因此，選擇30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 2. 3 提取溫度對(duì)花椰菜總黃酮提取效果的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花椰菜總黃酮含量逐漸增加，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，總黃酮含量最高，顯著高于30、70和80 ℃時(shí)的總黃酮含量。故選擇30、40、50和60 ℃ 4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 2. 4 提取時(shí)間對(duì)花椰菜總黃酮提取效果的影響 由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花椰菜總黃酮含量不斷增加，超過(guò)1.5 h后，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，總黃酮含量反而逐漸降低；提取1.5 h所得的花椰菜總黃酮含量顯著高于0.5和3.0 h的總黃酮含量。因此，選擇1.0、1.5、2.0和2.5 h 4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響花椰菜總黃酮含量的各因素主次排序?yàn)椋篈>D>C>B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響花椰菜總黃酮提取效果的主要因素，其次為提取時(shí)間和提取溫度，而液料比的影響相對(duì)較小。根據(jù)極差分析得到花椰菜總黃酮提取的最佳工藝組合為A1B3C4D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比50∶1、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2.0 h；根據(jù)直觀分析得到花椰菜總黃酮提取的最佳工藝組合為A1B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、液料比為50∶1、提取溫度為50 ℃、提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，花椰菜總黃酮含量最高，為0.919 mg/g。因極差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果不同，故需通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件。

2. 4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照極差分析優(yōu)選出的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定3次，花椰菜總黃酮平均含量為0.932 mg/g，RSD為1.56%，總黃酮含量高于正交試驗(yàn)中任何一組數(shù)據(jù)，說(shuō)明利用正交試驗(yàn)的極差分析優(yōu)選出的提取工藝合理可行。

3 討論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比4因素的4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以優(yōu)化花椰菜總黃酮提取工藝，結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響花椰菜總黃酮提取效果的主要因素，其次是提取時(shí)間和提取溫度，而液料比影響相對(duì)較小，與杜敏華和張彩瑩（2007）的研究結(jié)果一致。在單因素試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，花椰菜總黃酮含量最高，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大，總黃酮含量反而下降，其原因可能是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增至一定值，溶液極性顯著增強(qiáng)，溶液中一些溶于乙醇的雜質(zhì)溶出，與黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)同乙醇—水分子的結(jié)合，從而致使總黃酮溶解度降低（陳嬋等，2015）。今后可在乙醇體積分?jǐn)?shù)方面進(jìn)行深入探究，以期找出更佳的試驗(yàn)水平。

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到花椰菜總黃酮提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比50∶1、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2.0 h，在此條件下得到花椰菜總黃酮含量為0.932 mg/g；而周向軍等（2010）利用響應(yīng)面法對(duì)西蘭花總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、液固比30∶1、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間1.82 h，得率為0.853%。對(duì)比可知，本研究的提取工藝條件相對(duì)較溫和，提取率也較高，可有效提取花椰菜總黃酮。

4 結(jié)論

正交試驗(yàn)優(yōu)選的乙醇浸提工藝操作簡(jiǎn)便、合理可行，是提取花椰菜總黃酮的有效方法。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）