毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4原核表達(dá)及蛋白純化

張強(qiáng) 李麗紅 要笑云 蔣璐瑤 王瑩 撖靜宜 曹山 李慧 陸海

摘要：【目的】對毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4進(jìn)行原核表達(dá)及重組蛋白純化，為進(jìn)一步研究該基因的酶學(xué)特征和生理功能打下基礎(chǔ)。【方法】從毛果楊中克隆兩個(gè)半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET-30a-PtCP2及pET-30a-PtCP4，并在轉(zhuǎn)入大腸桿菌后在體外誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，采用包涵體洗滌法對目的蛋白進(jìn)行純化。【結(jié)果】PtCP2基因CDS序列全長1107 bp，編碼368個(gè)氨基酸；PtCP4基因CDS序列全長1104 bp，編碼367個(gè)氨基酸。PtCP2和PtCP4基因編碼的蛋白均屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶。PtCP2和PtCP4基因在毛果楊根、莖、葉中均有表達(dá)，其中PtCP2在葉中表達(dá)量最高，PtCP4在根中表達(dá)量最高。通過包涵體洗滌法在體外得到了高表達(dá)量、單一的重組蛋白PtCP2和PtCP4，切除信號(hào)肽后蛋白酶大小分別為38.151和38.069 kD?！窘Y(jié)論】原核表達(dá)獲得的純化重組蛋白PtCP2和PtCP4可用于進(jìn)一步研究毛果楊半胱氨酸蛋白酶的酶學(xué)特征和生理功能。

關(guān)鍵詞： 毛果楊；半胱氨酸蛋白酶；原核表達(dá)；蛋白純化；定量PCR

中圖分類號(hào)： Q785；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）04-0511-08

0 引言

【研究意義】半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease）是植物體內(nèi)一類十分龐大的蛋白酶家族，廣泛參與植物的各生理過程（Ahmad et al.，2014）。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物各組織器官的衰老與半胱氨酸蛋白酶關(guān)系密切。木本植物的細(xì)胞程序性死亡（PCD）過程主要表現(xiàn)為木質(zhì)部形成、葉衰老等，而毛果楊基因組已全部測序并公布，可作為木本植物研究中的模式生物，因此，深入研究毛果楊半胱胺酸蛋白酶PtCP2和PtCP4，對木材的利用和改良等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明，在干旱、低溫等非生物脅迫條件下，半胱氨酸蛋白酶基因的表達(dá)會(huì)明顯上升（Battelli et al.，2014）；在細(xì)胞衰老和細(xì)胞程序性死亡過程中，半胱氨酸蛋白酶也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用（Zhang et al.，2014）。Wagstaff等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，萱草科植物中的半胱氨酸蛋白酶基因SEN11和SEN102均在花的衰老過程中表達(dá)，其中，SEN102基因在萱草屬的葉片衰老過程中呈下調(diào)表達(dá)，但在花的衰老過程中呈上調(diào)表達(dá)；在擬南芥葉片的衰老過程中，有8個(gè)半胱氨酸蛋白酶基因表達(dá)，其中最引人注目的是木瓜蛋白酶SAG12，被認(rèn)為是衰老的標(biāo)志性蛋白（Wan et al.，2002；McLellan et al.，2009）；與擬南芥RD19蛋白同源率較高的MsCyp15A則被發(fā)現(xiàn)在苜蓿葉片衰老進(jìn)程中發(fā)揮十分重要的作用（Bernoux et al.，2008）。Mackey等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，RD19類基因主要編碼干旱誘導(dǎo)性半胱氨酸蛋白酶，青枯雷爾氏菌引發(fā)的干旱脅迫可以導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，但這類蛋白在干旱脅迫中的作用機(jī)理目前尚不明確；研究還發(fā)現(xiàn)RD19類蛋白的失活會(huì)導(dǎo)致感染植物中細(xì)菌大量繁殖。目前，已有很多半胱氨酸蛋白酶基因在體外表達(dá)且相應(yīng)蛋白酶已成功進(jìn)行純化。半滑舌鰨中的半胱氨酸蛋白酶基因CsCatB已成功進(jìn)行原核表達(dá)并純化，且在35 ℃和pH 5.5條件下獲得最大酶活性（Chen and Sun，2012）；另外，Nandana等（2014）成功將牛角瓜半胱氨酸蛋白酶基因Procerain B進(jìn)行原核表達(dá)及純化，并在pH 4.0條件下成功體外激活。【本研究切入點(diǎn)】目前，半胱胺酸蛋白酶在草本植物中研究比較透徹，但由于木本植物生長周期長于草本植物等原因，半胱氨酸蛋白酶在木本植物中的研究明顯滯后。【擬解決的關(guān)鍵問題】以毛果楊為試驗(yàn)材料，在體外大量表達(dá)毛果楊重組蛋白PtCP2和PtCP4的基礎(chǔ)上，探討重組蛋白的純化方法，建立一套合理有效的包涵體蛋白純化體系，為今后進(jìn)一步研究該基因的生理功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料毛果楊（Populus trichocarpa Torr. & Gray）由北京林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5α和BL21及表達(dá)載體pET-30a由北京林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司。Easyspin Plus植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技公司；FastQuant RT Kit試劑盒購自Promega公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及SuperReal熒光定量預(yù)混試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司；Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa公司；Taq 10 MasterMix購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、尿素、胃蛋白酶等購自Sigma公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 PtCP2和PtCP4基因的克隆與分析 按照艾德萊公司的植物全RNA提取試劑盒操作流程提取毛果楊葉片RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。將提取的RNA按照Promega公司的RT-PCR試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過在毛果楊數(shù)據(jù)庫JGI上檢索獲得半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，根據(jù)基因序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物PtCP2（上游引物：5'-ATGTCTCTCAACCTCTCTCTCTTTC-3'，下游引物：5'-CTAGAGGGAGTTGGTCTGCACG-3'）和PtCP4（上游引物：5'-GTCCAAACCATGGAACGCTTAC-3'，下游引物：5'-CACAGCAATCTACTGGGCAG-3'），以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行特定目的片段PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25.0 μL）：0.5 μL Ex Taq酶，2.5 μL 10×Ex Taq Buffer，2.5 μL dNTP，上下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 15.5 μL。擴(kuò)增程序： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)挑菌后進(jìn)行PCR初步鑒定，將陽性克隆送至北京六合華大基因公司測序。對克隆得到的毛果楊PtCP2和PtCP4基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析：使用SignalP 3.0軟件對PtCP2和PtCP4基因的信號(hào)肽序列進(jìn)行預(yù)測；使用ExPASy軟件對PtCP2和PtCP4基因編碼的蛋白酶PtCP2和PtCP4的等電點(diǎn)、分子量等要素進(jìn)行分析預(yù)測；使用MEGA 5.1軟件對蛋白酶PtCP2和PtCP4進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建；使用BioEdit軟件將蛋白酶PtCP2和PtCP4與已知RD19A類蛋白酶進(jìn)行氨基酸序列比對。

1. 2. 2 PtCP2和PtCP4基因的組織表達(dá)分析 以毛果楊的根、莖、葉為試驗(yàn)材料分別提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物PtCP2（上游引物：5'-CTTTAGCGTGGTGTCCCT-3'，下游引物：5'-CTCCTCCAATGTATGTTTGC-3'）和PtCP4（上游引物：5'-GGAACGCTTACCTCTGCT-3'，下游引物：5'-TGACACGACTTGCCTGAT-3'），以各部位cDNA為模板，按SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒操作流程分別對PtCP2和PtCP4基因進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)體系（20.0 μL）：10.0 μL 2×SuperReal PreMix Plus，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板0.7 μL，ddH2O 8.3 μL。熒光定量PCR程序： 95 ℃預(yù)變性15 min； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，然后以0.5 ℃/s的速度升至95 ℃，進(jìn)行61個(gè)循環(huán)。每個(gè)根、莖、葉試驗(yàn)組均設(shè)1個(gè)對照組，對照組采用與試驗(yàn)組相同部位的cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，每組試驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1. 2. 3 PtCP2和PtCP4基因原核表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá) 用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I對毛果楊PtCP2、PtCP4基因和原核表達(dá)載體pET-30a同時(shí)進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的產(chǎn)物，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行體外連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)挑菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，獲得pET-30a-PtCP2和pET-30a-PtCP4表達(dá)載體。PCR鑒定體系（25.0 μL）：12.5 μL 2×Taq 10 MasterMix，上、下游引物各1.0 μL，質(zhì)粒1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。雙酶切鑒定體系（20.0 μL）：2.0 μL 10×M Buffer，Kpn I 1.0 μL，Xho I 1.0 μL，質(zhì)粒16.0 μL。

將上述構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，于37 ℃、200 r/min條件下在含有卡那霉素（50 mg/L）的LB中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入經(jīng)抽濾的IPTG溶液（終濃度為0.3 mmol/L），于28 ℃、140 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。取1 mL菌液用SDS-PAGE檢測蛋白條帶，以相同培養(yǎng)條件下未加IPTG菌液為對照，檢測重組蛋白是否在體外表達(dá)。

1. 2. 4 重組蛋白PtCP2和PtCP4的純化 將獲得的誘導(dǎo)菌液在4 ℃、4000 r/min條件下離心10 min，收集菌體后用Tris緩沖液（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris、pH 8.0）重懸，超聲波破碎200次直至菌液澄清，于4 ℃、12000 r/min條件下離心30 min獲得含有目的蛋白的包涵體。對包涵體蛋白采用包涵體洗滌法進(jìn)行純化，使用包涵體洗滌液（1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.5% Triton X-100、2 mmol/L β-巰基乙醇、2 mol/L 尿素、pH 8.0）將包涵體蛋白重懸，置于冰上后于水平搖床上搖動(dòng)20 min，然后4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min，棄去上清液，重復(fù)5次。用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液將最終獲得的包涵體蛋白重懸，超聲波破碎50次，4 ℃、12000 r/min條件下離心30 min，獲得含有重組蛋白的上清液，用SDS-PAGE檢測蛋白純度，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。

1. 2. 5 重組蛋白PtCP2和PtCP4的復(fù)性及酶原激活

測定上一步純化的重組蛋白濃度后，用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液將蛋白濃度稀釋至100 ng/μL以下復(fù)性。將稀釋后的重組蛋白依次放入含6、4、2 mol/L尿素的復(fù)性液（含1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L還原型谷胱甘肽、0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽）中，每個(gè)梯度低溫?cái)嚢柰肝? h，經(jīng)2 mol/L尿素復(fù)性后將重組蛋白放入不含尿素的復(fù)性液中繼續(xù)低溫?cái)嚢柰肝? d，期間更換1次復(fù)性液，最后收集蛋白溶液。

用HAc-NaAc緩沖液（pH 4.0）對復(fù)性蛋白進(jìn)行酸化，酸化環(huán)境為pH 4.5，反應(yīng)時(shí)間分別為30 s、1 min、5 min、10 min、30 min、1 h、6 h、12 h、1 d和3 d，待酸化完成后加入1 mol/L NaOH中和反應(yīng)體系，終止酸化反應(yīng)。使用SDS-PAGE檢測酸化條帶，對照組為未酸化蛋白。另外，本研究采用組織蛋白酶B催化的方法進(jìn)行酶原激活（Gogiel et al.，2012），在上述酸化體系中加入終濃度為10 μg/mL的組織蛋白酶B，以幫助酶原激活，按照上述時(shí)間梯度進(jìn)行酸化，待酸化完成后，使用1 mol/L NaOH中和反應(yīng)體系，終止酸化反應(yīng)；使用SDS-PAGE檢測酸化條帶，對照組分別為未酸化蛋白和組織蛋白酶B。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PtCP2和PtCP4基因克隆及蛋白序列分析

以毛果楊cDNA為模板，分別使用PtCP2和PtCP4特異性引物進(jìn)行PCR克隆并測序。結(jié)果（圖1）顯示，PtCP2基因（JGI基因編號(hào)grail3.0001039901）全長1107 bp，編碼368個(gè)氨基酸，通過SignalP 3.0軟件預(yù)測該蛋白信號(hào)肽為21個(gè)氨基酸，去除信號(hào)肽后分子量為38.151 kD，理論等電點(diǎn)為6.11；PtCP4基因（JGI基因編號(hào)grail3.0002061802）全長1104 bp，編碼367個(gè)氨基酸，通過SignalP 3.0軟件預(yù)測該蛋白信號(hào)肽為20個(gè)氨基酸，去除信號(hào)肽后分子量為38.069 kD，理論等電點(diǎn)為6.44。選取木本棉體內(nèi)的已知RD19A類蛋白酶KHG24064和KHG15062與PtCP2、PtCP4進(jìn)行序列比對，結(jié)果（圖2）表明，PtCP2中的C160、H303、N330及PtCP4中的C159、H302、N329組成催化三聯(lián)體，其為木瓜蛋白酶的核心催化殘基。由于PtCP2和PtCP4蛋白結(jié)構(gòu)域中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件組成花環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且蛋白酶結(jié)構(gòu)域中VxNFS或VxNFT元件中有保守的PGS序列（NxS/T），因此可以推論P(yáng)tCP2和PtCP4屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

分別選擇來自木本棉（Gossypium arboreum）、大豆（Glycine soja）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）及菜豆（Phaseolus vulgaris）的RD19A類蛋白酶的物種和基因及分別來自木本棉、大豆、擬南芥、小球藻（Auxenoc-hlorella protothecoides）、桑樹（Morus notabilis）、玉米（Zea mays）及節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii）的RD21A類蛋白酶的物種和基因，對毛果楊半胱氨酸蛋白酶PtCP2和PtCP4進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果（圖3）顯示，PtCP2與木本棉RD19A類蛋白KHG15253和KHG24064同源率較高，PtCP4則與木本棉RD19A類蛋白KHG15062同源率較高，此外，其所在的亞組還包括其他所有選取的RD19A類蛋白，由此可以看出PtCP2和PtCP4與其他物種的RD19A類蛋白親緣關(guān)系較近；而在與8類RD21A類蛋白的同源性比較中發(fā)現(xiàn)，PtCP2和PtCP4與其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2. 3 PtCP2和PtCP4基因的組織表達(dá)特性分析

為研究PtCP2和PtCP4基因在不同組織器官的表達(dá)量，分別取毛果楊的根、莖、葉3個(gè)部位的材料提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，PtCP2和PtCP4基因在毛果楊根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，PtCP2基因在葉中的表達(dá)量最高，是內(nèi)參基因β-actin表達(dá)量的3.180倍，根次之，莖中表達(dá)量最低（圖4-A）；PtCP4基因則在根中的表達(dá)量最高，為內(nèi)參基因β-actin表達(dá)量的0.285倍，葉次之，莖中表達(dá)量最低（圖4-B）；PtCP2基因整體表達(dá)量明顯高于PtCP4基因。

2. 4 PtCP2和PtCP4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

由于PtCP2和PtCP4基因中包含信號(hào)肽序列，該序列不能在原核生物中表達(dá)，因此需要在構(gòu)建原核表達(dá)載體時(shí)去除該部分序列。以已克隆得到的毛果楊PtCP2和PtCP4基因?yàn)槟０?，用特異性引物通過PCR擴(kuò)增得到目的片段，大小約1044 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖5）。將該片段回收，與pMD-18T連接，獲得陽性克隆并測序正確。

使用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I分別對克隆載體pMD18-T-PtCP2和pMD18-T-PtCP4進(jìn)行酶切獲得目的片段，與表達(dá)載體pET-30a連接，獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒雙酶切電泳檢測結(jié)果（圖6）顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后獲得長度約5400 bp的大片段和1000 bp的小片段，分別與表達(dá)載體pET-30a和目的片段大小相符。

2. 5 重組蛋白PtCP2和PtCP4的表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒pET-30a-PtCP2和pET-30a-PtCP4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后體外誘導(dǎo)表達(dá)，所得蛋白為包涵體形式。采用包涵體洗滌法對目的蛋白進(jìn)行純化，所得重組蛋白PtCP2和PtCP4去除信號(hào)肽后理論分子量大小分別為38.151和38.069 kD，與His-tag（5.3 kD）結(jié)合后，大小分別約為43.5和43.4 kD（圖7）。

2. 6 重組蛋白PtCP2和PtCP4的體外酶原激活結(jié)果

對酶原進(jìn)行體外激活，結(jié)果顯示，在酸性條件下，酶原出現(xiàn)降解，且隨著酸化時(shí)間的延長酶原降解程度增加，在酸化達(dá)24 h后，酶原完全降解，但沒有新的成熟酶條帶產(chǎn)生；在組織蛋白酶B催化條件下，單位時(shí)間內(nèi)酶原降解程度較酸性條件下有所增加，在16 h左右即可完全降解，但同樣沒有成熟酶條帶產(chǎn)生。表明這兩個(gè)蛋白酶不能在本研究酸性條件下完成酶原激活，也不能在組織蛋白酶B催化條件下完成酶原激活，可能需要其他蛋白酶參與其酶原激活過程。

3 討論

半胱氨酸蛋白酶主要分為木瓜蛋白酶（Papain）、豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶（Legumain）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）和鈣依賴半胱氨酸蛋白酶（Calpain）（Barrett and Rawlings，2001），其中木瓜蛋白酶是種類最多，研究最深入、最透徹的一類（Bar-Ziv et al.，2015）。木瓜蛋白酶家族成員均含有1個(gè)由保守氨基酸殘基組成的催化三聯(lián)體Cys25-His159-Asn175，這一結(jié)構(gòu)也是木瓜蛋白酶家族的分類標(biāo)志之一（閆龍鳳等，2005）。木瓜蛋白酶家族成員主要分為9類：RD21A-like、RD19A-like、CEP 1-like、XCP2-like、XBCP3-like、THIl-like、SAG12-like、AALP-like和CTB3-like（Ri-chau et al.，2012）。其中，RD19A-like在蛋白結(jié)構(gòu)域中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件，蛋白酶結(jié)構(gòu)域存在VxNFS或VxNFT元件且元件中存在保守的PGS序列（NxS/T）。RD19類蛋白酶家族與動(dòng)物組織蛋白酶F相似，可以劃分為RD19A、RD19B和RD19C 3個(gè)亞家族（Babula-Skowrońska et al.，2015）。本研究成功克隆獲得毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，通過氨基酸序列分析表明PtCP2蛋白中的C160、H303、N330及PtCP4蛋白中的C159、H302、N329與木瓜蛋白酶保持一致，是證明其屬于木瓜蛋白酶家族的重要證據(jù)；另外，PtCP2和PtCP4蛋白結(jié)構(gòu)中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件，蛋白酶結(jié)構(gòu)域中存在VxNFS或VxNFT元件且元件中有保守的PGS序列（NxS/T），這些都是PtCP2和PtCP4屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶的重要證據(jù)。

有研究表明擬南芥的RD系列基因與干旱脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫有密切聯(lián)系（Yang et al.，2011），但對高溫和低溫等脅迫無響應(yīng)。本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和蛋白質(zhì)序列比對分析，發(fā)現(xiàn)PtCP2、PtCP4和擬南芥AT4G39090基因編碼的RD19A蛋白同屬于RD19A亞家族且具有很高的同源性，由于同一亞家族的基因功能通常相似，因此推測毛果楊PtCP2和PtCP4基因與非生物脅迫相關(guān)。通過組織表達(dá)定量結(jié)果分析，本研究發(fā)現(xiàn)PtCP2和PtCP4基因表達(dá)存在明顯差異，推測這兩個(gè)基因具有不同的生物學(xué)功能。進(jìn)一步檢索楊樹EST數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均在干旱脅迫條件下大量表達(dá)，但表達(dá)時(shí)期和表達(dá)量存在顯著差異，表明這兩個(gè)基因可能在參與干旱脅迫應(yīng)答的不同時(shí)期起作用，將是今后基因功能研究的重點(diǎn)方向。

木瓜蛋白酶的氨基酸序列從N端到C端按其功能可以劃分為3個(gè)區(qū)域：信號(hào)肽序列、前體肽序列和成熟酶序列（Wiederanders，2003）。信號(hào)肽作為引導(dǎo)新生蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的短肽鏈，在木瓜蛋白酶進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后即被切除，蛋白質(zhì)則以一種前體酶的形式存在，不具備活性，前體肽序列則在酶發(fā)揮活性時(shí)被自動(dòng)切除，形成具有活性的成熟酶（Riese and Chapman，2000；Martinez and Diaz，2008）。氨基酸序列分析結(jié)果表明，RD19類蛋白酶家族與動(dòng)物組織蛋白酶F相似，但也有報(bào)道把組織蛋白酶F歸入組織蛋白酶L類（Wex et al.，2000）。有報(bào)道顯示與RD19A類蛋白相似度很高的組織蛋白酶L在弱酸性環(huán)境中易被活化（Fonseca et al.，2012），但新產(chǎn)生的成熟酶在堿性和中性環(huán)境中無法穩(wěn)定存在。因此，本研究選用pH 4.0～5.5作為酸化環(huán)境，同時(shí)在組織蛋白酶B催化條件下對酶原進(jìn)行激活，但經(jīng)酸化后始終無法獲得穩(wěn)定的成熟酶序列。分析原因，可能是RD19A類蛋白酶在進(jìn)行前體肽切除后成熟酶無法在酸性環(huán)境下穩(wěn)定存在，需要自身體內(nèi)異體蛋白酶的催化，有助于穩(wěn)定成熟酶的結(jié)構(gòu)，這一部分工作將成為今后的研究重點(diǎn)。

本研究將PtCP2和PtCP4基因與原核表達(dá)載體pET-30a連接，在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功誘導(dǎo)表達(dá)，采用包涵體洗滌法對目的蛋白進(jìn)行純化即可獲得單一的目的蛋白。此外，本研究通過熒光定量PCR對PtCP2和PtCP4基因進(jìn)行組織表達(dá)分析，初步分析了該基因可能的功能。為了更加透徹地研究PtCP2和PtCP4的生物學(xué)功能，下一步將構(gòu)建這兩個(gè)基因的正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，并對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行性狀分析，初步鑒定該基因在PCD過程中的作用，為進(jìn)一步揭示PtCP2和PtCP4在毛果楊體內(nèi)的功能提供參考。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得了毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)包涵體洗滌法純化后獲得重組蛋白PtCP2和PtCP4，為進(jìn)一步研究毛果楊半胱氨酸蛋白酶的酶學(xué)特征和生理功能打下基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）