金花茶種子萌發(fā)與快速繁殖技術(shù)研究

黃昌艷　周主貴　王曉國(guó)　盧家仕　關(guān)世凱　卜朝陽(yáng)

摘要：【目的】研究防城港金花茶種子萌發(fā)及組培快繁技術(shù)，初步建立金花茶組織培養(yǎng)體系，為金花茶的組培快繁利用提供參考。【方法】以金花茶種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)不同種子的發(fā)育程度處理、17個(gè)不同培養(yǎng)基的激素濃度處理，測(cè)定不同處理對(duì)金花茶種子萌發(fā)率、增殖系數(shù)、株高、葉片數(shù)等的影響，篩選出適宜金花茶組培苗生長(zhǎng)的萌發(fā)、繼代和壯苗培養(yǎng)基?！窘Y(jié)果】選用胚乳直徑大于1.0 cm的金花茶種子接種于MS+GA3 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，萌發(fā)率可達(dá)82.4%；金花茶組培苗增殖系數(shù)隨6-BA濃度增加呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L時(shí)增殖系數(shù)最大，達(dá)3.79；適宜金花茶壯苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，其平均株高、葉片數(shù)、莖粗等均優(yōu)于其他處理；在黃泥∶泥炭=1∶1組合處理下金花茶組培苗移栽生根率最高，達(dá)61%，成活率也較高，為90%。【結(jié)論】廣西防城港金花茶適宜的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+GA3 1.0 mg/L、繼代增殖培養(yǎng)以MS+6-BA 3.0 mg/L效果較好、壯苗培養(yǎng)基以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L較適宜、黃泥∶泥炭=1∶1作為金花茶組培苗移栽基質(zhì)最適宜。

關(guān)鍵詞： 金花茶；種子萌發(fā)；快速繁殖

中圖分類號(hào)： S685.14 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）05-0611-06

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to investigate seed germination and rapid propagation technologies of Camellia nitidissima from Fangchenggang，Guangxi， and establish its tissue culture system， in order to provide a basis for tissue culture and rapid propagation of C. nitidissima. 【Method】The tissue culture experiment was conducted with C. nitidissima seeds at 3 development degrees as explants and 17 kinds of culture media with different hormone concentrations. Then the effects of these treatments on seed germination rate， multiplication coefficient， plant height and leaf number were investigated， so as to screen optimal medium for multiplication and strengthening seedling culture. 【Result】The results showed that， the selected seeds with endosperm diameter of greater than 1.0 cm were inoculated into culture medium of MS+GA3 1.0 mg/L， and the germination rate was up to 82.4%. The multiplication coefficient first rose and then declined with increase of 6-BA concentration， when 6-BA was at 3.0 mg/L， the multiplication coefficient was up to 3.79. Moreover， the optimal culture medium for strengthening seedlings was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L in this culture medium， the average plant height， average leaf number and average plant height were better than those in other kinds of culture media. When yellow mud/peat ratio in culture substrate for transplantation was 1∶1， the rooting rate of tissue-cultured seedling after transplanting were the highest（61%）， and the survive rate was up to 90%. 【Conclusion】The optimal culture medium for seed germination of Camellia nitidissima from Fangchenggang， Guangxi is MS+GA3 1.0 mg/L， and the optimal culture medium for multiplication is MS+6-BA 3.0 mg/L， the optimal culture medium for strengthening seedlings is MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L， the yellow mud/peat ratio of 1∶1 is optimum in culture substrate for transplantation.

Key words： Camellia nitidissima； seed germination； rapid propagation

0 引言

【研究意義】金花茶（Camellia nitidissima）是世界珍稀觀賞植物和種質(zhì)資源，與銀杉、桫欏、珙桐等珍貴“植物活化石”齊名，國(guó)外稱之為神奇的東方魔茶，被譽(yù)為“植物界大熊貓”、“茶族皇后”，觀賞價(jià)值極高（韋霄等，2010）。金花茶不僅有較高的觀賞價(jià)值，還具有一定的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其葉和花為壯族民間用藥；此外，金花茶含有特殊的色澤遺傳基因，具有重要的科研價(jià)值。金花茶組植物在自然狀態(tài)下的自我繁殖能力較弱，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求較苛刻，而近年來(lái)人類對(duì)其不合理的采挖和利用導(dǎo)致其生境條件遭受嚴(yán)重破壞，致使金花茶組植物資源種群發(fā)展受到嚴(yán)重威脅。為有效保育金花茶組植物種質(zhì)資源，通過(guò)人工快速繁育及栽培，可大力發(fā)展金花茶組植物種植業(yè)，充分發(fā)揮金花茶種質(zhì)資源的應(yīng)有價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于金花茶繁殖方面的研究國(guó)內(nèi)已有一些報(bào)道。顏慕勤等（1988）研究了廣西7種金花茶的組織培養(yǎng)技術(shù)，篩選出適宜的培養(yǎng)基為改良ER培養(yǎng)基（ER培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量從472.2 mg/L減為374.6 mg/L，胺態(tài)氮含量從210.0 mg/L減為174.2 mg/L），產(chǎn)生胚狀體的培養(yǎng)基附加激素量為2，4-D 2.0 mg/L+BA 0.5 mg/L，產(chǎn)生叢生芽的激素為BA 2.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L。楊成華等（1996）和蔣橋生等（2007）均認(rèn)為金花茶在黃心土的扦插成活率最高。楊泉光等（2013）認(rèn)為用河沙培育東興金花茶種子最有利于種苗的發(fā)育，其發(fā)芽率、苗高、須根數(shù)、須根長(zhǎng)均優(yōu)于黃土和珍珠巖所培育的種苗。楊舒婷等（2013）報(bào)道崇左金花茶幼嫩葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為改良MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D；幼嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為改良MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D；種子愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為改良MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4-D。鄧蔭偉等（2014）研究表明，金花茶芽苗砧嫁接除萌的最佳時(shí)間以嫁接定植75 d剪除砧木萌芽時(shí)留葉2片待30 d再剪除全部砧木萌芽的處理最佳，該處理下嫁接苗成活的保存率、抽梢率均較好?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已有利用金花茶種子進(jìn)行組培快繁的研究報(bào)道，但不同品種對(duì)培養(yǎng)基的要求不同，不同激素對(duì)不同金花茶品種的效應(yīng)也有所不同?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用金花茶種子進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，篩選出金花茶適宜的萌發(fā)、繼代、壯苗培養(yǎng)基，建立其快速繁殖體系，為金花茶的組培快繁利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

選取廣西防城港市原生種金花茶7～8成熟、尚未開裂、綠色、飽滿、無(wú)病蟲害的果實(shí)為供試材料。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 種子收集及處理 用毛刷刷干凈果實(shí)表面的雜質(zhì)，然后用飽和洗衣粉水浸泡20 min，流水沖洗20 min；置于超凈工作臺(tái)用75%酒精浸泡15 min，無(wú)菌水洗3次，然后用解剖刀剖開果實(shí)，取出種子，放入0.1%升汞中浸泡7 min，無(wú)菌水洗4次，最后在接種盤中切開種皮，取出胚乳，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將有胚芽的一端置于培養(yǎng)基底部，操作過(guò)程中不得傷及種子胚芽部分。

1. 2. 2 種子發(fā)育程度對(duì)萌發(fā)的影響 將獲取的胚乳視發(fā)育程度分為3個(gè)等級(jí)：?。ㄖ睆叫∮?.5 cm）、中（直徑為0.5～1.0 cm）、大（直徑大于1.0 cm）。將種子接入MS+GA3 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，60 d后觀察種子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率并測(cè)量芽的高度。

培養(yǎng)基均采用MS為基本培養(yǎng)基，瓊脂0.45%，蔗糖3.00%，pH 5.8，經(jīng)121 ℃滅菌23 min后冷卻使用；培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度1500～2000 lx，光照時(shí)間每天12～14 h，溫度（26±2）℃（下同）。

1. 2. 3 不同激素及濃度對(duì)種子萌發(fā)的影響 選取大小一致的胚乳分別接種到7個(gè)處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表2）中，60 d后觀察種子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率并測(cè)量芽的高度。

1. 2. 4 6-BA對(duì)組培苗繼代培養(yǎng)的影響 在初始繼代培養(yǎng)中，將胚乳及胚芽取出，切掉頂芽及部分胚乳，剩余部分接入繼代培養(yǎng)基；切除頂芽后，易產(chǎn)生側(cè)芽，形成芽團(tuán)，隨著胚乳營(yíng)養(yǎng)的逐步消耗，后期繼代培養(yǎng)中切除胚乳。試驗(yàn)過(guò)程中，選擇芽的高度小于1.5 cm的小芽或芽團(tuán)接入4個(gè)處理的繼代培養(yǎng)基（表3）中，接種前統(tǒng)計(jì)芽的數(shù)量，60 d后觀察植株生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)總芽量，計(jì)算增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=總芽量/原芽量

1. 2. 5 不同培養(yǎng)基對(duì)壯苗的影響 將叢生芽取出，并把高于1.5 cm的小芽切出，接入6個(gè)壯苗培養(yǎng)基（表4）中，50 d后觀察植株生長(zhǎng)情況，測(cè)量株高、莖粗，統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)。

1. 2. 6 生根移栽 將壯苗過(guò)程中的小苗放置于煉苗室進(jìn)行煉苗，煉苗溫度（25±7）℃，光照強(qiáng)度5000 lx，20 d后移栽。移栽前2 d，打開瓶蓋，讓小苗適應(yīng)外部空氣濕度；取出小苗，洗去培養(yǎng)基，將小苗的基部置于750 mg/L IBA溶液中浸泡10 min，然后分別種植在純黃泥、純泥炭、黃泥∶泥炭=1∶1等3種基質(zhì)中。調(diào)試自動(dòng)噴淋系統(tǒng)，8：00～18：00期間每間隔1 h噴水1次，每次噴淋30～60 s，根據(jù)不同季節(jié)調(diào)整噴淋時(shí)間，一般夏季長(zhǎng)、冬季短。60 d后，觀察植株生長(zhǎng)情況，計(jì)算成活率、生根率。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王紹華設(shè)計(jì)的STST方差分析軟件進(jìn)行分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 種子發(fā)育程度對(duì)萌發(fā)的影響

從表1可以看出，胚乳大小對(duì)萌發(fā)率影響顯著（P<0.05，下同），其中小等級(jí)處理與中、大等級(jí)處理間達(dá)極顯著差異水平（P<0.01，下同）；芽平均高度在3個(gè)等級(jí)處理間達(dá)極顯著差異水平，表現(xiàn)為胚乳直徑越大，萌發(fā)率越高。直徑小于0.5 cm的胚乳，其萌發(fā)率只有1.3%；直徑大于1.0 cm的胚乳，其萌發(fā)率可達(dá)89.3%，且萌發(fā)的芽粗壯，長(zhǎng)出葉片，部分種子長(zhǎng)出胚根，根毛多，部分胚芽長(zhǎng)側(cè)芽。因此，選用胚乳直徑大于1.0 cm的種子作為初代材料萌發(fā)率最高（圖1）。

2. 3 6-BA對(duì)組培苗繼代培養(yǎng)的影響

從表3可以看出，隨著6-BA濃度的升高，金花茶組培苗的增殖系數(shù)先上升后下降，并在3.0 mg/L時(shí)達(dá)最大值（3.79），其增殖系數(shù)與其他處理間達(dá)極顯著差異水平，此時(shí)產(chǎn)生大量側(cè)芽，原芽單株長(zhǎng)高變壯，部分葉片伸展（圖2）；當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，產(chǎn)生的側(cè)芽較少；當(dāng)6-BA濃度為5.0 mg/L時(shí)，產(chǎn)生的側(cè)芽不但偏少，而且呈畸形、透明狀，生長(zhǎng)緩慢，原芽的葉片易卷縮、掉落。因此，適宜金花茶繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L。

2. 4 不同培養(yǎng)基對(duì)組培苗壯苗的影響

從表4可以看出，在相同NAA水平下，高濃度6-BA容易使金花茶組培苗長(zhǎng)出側(cè)芽，但不利于單株變壯，因此壯苗適合選用較低濃度的6-BA；在低濃度6-BA下，添加0.05 mg/L NAA處理的長(zhǎng)勢(shì)比不添加的長(zhǎng)勢(shì)好，平均株高、葉片數(shù)、莖粗均優(yōu)于不添加的處理，但差異不顯著（圖3）；在高濃度6-BA處理下添加NAA容易使植株產(chǎn)生愈傷組織，但不利于單株變壯。研究還發(fā)現(xiàn)，添加活性炭1.0 mg/L的處理，組培苗的褐化程度降低，表明活性炭有利于減少金花茶在組培過(guò)程中因褐化而導(dǎo)致的死亡，但單株長(zhǎng)勢(shì)不如未添加的好。綜合考慮，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L最適宜金花茶壯苗生長(zhǎng)。

2. 5 基質(zhì)對(duì)金花茶組培苗移栽的影響

從表5可以看出，3種基質(zhì)中以純黃泥土處理金花茶組培苗的移栽成活率及生根率均最低，可能是由于純黃泥的基質(zhì)黏性太高，透氣性差，不利于組培苗生長(zhǎng)；純泥炭處理的金花茶組培苗移栽成活率較高，達(dá)92%，但該處理的生根率較低，只有39%；在黃泥∶泥炭=1∶1組合處理下金花茶組培苗移栽生根率最高，達(dá)61%，成活率也較高，為90%，添加泥炭能在一定程度上緩解黃泥土黏性太高的缺點(diǎn)，同時(shí)該處理的組培苗長(zhǎng)勢(shì)好，根多且壯（圖4）。因此，選用黃泥∶泥炭=1∶1作為金花茶組培苗移栽基質(zhì)最適宜。

3 討論

隨著金花茶市場(chǎng)的日漸走俏，種苗缺口不斷擴(kuò)大，篩選出一種高效、快速的金花茶種苗繁育技術(shù)尤為重要。目前，金花茶人工繁殖方法以枝條扦插為主，但枝條扦插繁殖耗費(fèi)的枝條多，成活率低，繁殖速度慢，不能滿足市場(chǎng)的需要，而采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行金花茶離體培養(yǎng)，可以加快金花茶繁殖速度，并獲得大量組培苗。鄧桂英（2001）對(duì)我國(guó)金花茶研究的文獻(xiàn)進(jìn)行了分析，從中得出金花茶研究的學(xué)科領(lǐng)域主要集中在遺傳育種、形態(tài)解剖與分類、種苗和木材等方面，雜交育種、染色體數(shù)目和核型、金花茶的分類與系統(tǒng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)繁殖和組織培養(yǎng)是其研究熱點(diǎn)。在金花茶外植體滅菌方面，楊舒婷等（2013）認(rèn)為幼嫩葉片和種子滅菌的效果較好，幼嫩葉片較好的滅菌方法為洗潔精清洗外植體表面+流水沖洗30 min+75%酒精30 s+

0.1% HgCl2 5 min；種子較好的滅菌方法為洗潔精清洗外植體表面+流水沖洗30 min+75%酒精40 s+0.1% HgCl2 20～30 min+0.2% HgCl2 20 min。李桂娥等（2015）使用的滅菌方法為剝掉金花茶種子種皮，先用75%酒精表面消毒30～60 s，然后用5%～10%的NaClO溶液消毒20～30 min，最后在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌蒸餾水沖洗。本研究中用75%酒精浸泡果實(shí)15 min，無(wú)菌水洗3次，然后用解剖刀剖開果實(shí)，取出種子，放入0.1%升汞中浸泡7 min，無(wú)菌水洗4次，試驗(yàn)中滅菌方法采用保留種皮滅菌，能更好地保護(hù)種胚，避免其受到升汞的毒害導(dǎo)致發(fā)芽率降低。莖段的消毒相對(duì)較難，普遍認(rèn)為采用分段滅菌的方法效果較好（林莉和賴鐘雄，2005；楊舒婷等，2013），幼嫩莖段采用洗潔精清洗外植體表面+流水沖洗30 min+75%酒精25 s+

0.1% HgCl2 10 min+0.2% HgCl2 5 min的滅菌方法好；半木質(zhì)化莖段采用洗潔精清洗外植體表面+流水沖洗30 min+75%酒精35 s+0.1% HgCl2 12 min+0.2% HgCl2 6 min的滅菌方法好。芽和花苞的消毒最難，采用NaClO原液+HgCl2分段滅菌，并逐次剝?nèi)ネ鈱影M(jìn)行滅菌的方法也難以達(dá)到預(yù)期效果。

本研究結(jié)果表明，選用胚乳直徑大于1.0 cm的種子接種于MS+GA3 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)率可達(dá)82.4%，與周健等（2005）認(rèn)為GA3能較好地促進(jìn)茶樹芽頭生長(zhǎng)成為小苗的試驗(yàn)結(jié)果相似，但在金花茶組培文章中尚未見試用GA3進(jìn)行種子誘導(dǎo)萌發(fā)的報(bào)道。

在愈傷組織誘導(dǎo)方面，金花茶的幼嫩葉片、幼嫩莖段和種子均可以進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。在金花茶莖段離體培養(yǎng)方面，廖漢刃等（1987）報(bào)道以改良MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA 0.5～4.0 mg/L+IAA（或IBA）0.5～ 1.0 mg/L，腋芽同樣能生長(zhǎng)成芽團(tuán)和無(wú)根苗。林莉和賴鐘雄（2005）認(rèn)為在10～11月采摘金花茶的幼嫩莖段較易獲得無(wú)菌芽，并篩選出適合誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的培養(yǎng)基：改良WPM附加2 mg/L 6-BA及0.5 mg/L IAA，萌發(fā)率達(dá)57.1%，芽苗在附加3 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IAA的改良WPM培養(yǎng)基上增殖效果較好；王友生（2013）以3月采集的顯脈金花茶莖段為外植體進(jìn)行研究，其最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為WPM+6-BA 7 mg/L+NAA 0.25 mg/L；最佳增殖培養(yǎng)基為： 改良WPM（NO3-∶NH4+=2∶1）+

6-BA 5.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L。本研究篩選出的金花茶繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L，未使用生長(zhǎng)素。一般來(lái)說(shuō)，在金花茶組培苗快速繁殖時(shí)，生長(zhǎng)素的水平應(yīng)低一些，因?yàn)楦邼舛鹊纳L(zhǎng)素會(huì)導(dǎo)致愈傷組織形成，而愈傷組織的形成會(huì)降低增殖系數(shù)。同時(shí)，高濃度的6-BA能有效降低愈傷組織形成，有利于芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。在壯苗培養(yǎng)基中，本研究采用的是MS+ 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，與李桂娥等（2015）在專利中使用的IAA 0.5 mg/L差別較大，這兩種培養(yǎng)基均能促進(jìn)金花茶組培苗單株變壯，可能是由于品種不同所致。

生根難是木本植物組織培養(yǎng)中常遇到的難題，主要與植物的基因型、采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件有關(guān)。在金花茶組培苗生根研究方面，瓶?jī)?nèi)生根的基本培養(yǎng)基多為1/2MS（廖漢刃等，1987；林莉和賴鐘雄，2005），添加的激素及濃度為IBA 3.0～4.0 mg/L或NAA 4.0～6.0 mg/L。李桂娥等（2015）先將獲得的金花茶無(wú)菌苗基部浸泡于800 mg/L的IBA溶液中15 min，然后轉(zhuǎn)接于MW 生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率可達(dá)98%，根系發(fā)達(dá)，須根較多，因此今后可采用上述方法進(jìn)行改進(jìn)。從金花茶瓶外生根效果看，黃曉娜等（2014）利用200 mg/L IBA浸泡金花茶無(wú)菌苗10 min，種植于黃泥∶泥炭土=3∶1基質(zhì)中，生根率達(dá)85%，高于本研究結(jié)果，可能是由于本研究選擇的激素濃度過(guò)高導(dǎo)致生根率低，今后要進(jìn)行更多的對(duì)比試驗(yàn)，篩選適宜的激素濃度、基質(zhì)配比、移栽方式方法等，選出最優(yōu)的金花茶瓶外生根方法。

4 結(jié)論

本研究初步篩選出MS+GA3 1.0 mg/L、MS+6-BA 3.0 mg/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L可分別作為廣西防城港金花茶種子萌發(fā)、繼代增殖、壯苗的適宜培養(yǎng)基。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）