不同發(fā)酵方式對(duì)海南粗榧內(nèi)生真菌CH1307c合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

林淑婷　李從發(fā)　胡曉蘋　劉翊昊　徐傳標(biāo)　李培　周偏　劉四新

摘 要 為研究不同發(fā)酵方式對(duì)內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量、成分類別及其對(duì)3種常見白血病細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性影響。分別采用大米固態(tài)發(fā)酵、麥麩固態(tài)發(fā)酵、馬鈴薯液態(tài)靜置發(fā)酵、馬鈴薯動(dòng)態(tài)發(fā)酵4種發(fā)酵方式對(duì)分離自海南粗榧韌皮部?jī)?nèi)生真菌CH1307c進(jìn)行發(fā)酵，并采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，通過試管定性試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)測(cè)定其粗提物的成分類別及其對(duì)細(xì)胞株K562、NB4、HL60的細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明：大米固態(tài)發(fā)酵、麥麩固態(tài)發(fā)酵的次級(jí)代謝粗提物產(chǎn)量相對(duì)于馬鈴薯動(dòng)態(tài)發(fā)酵分別增加了45.9倍和28倍；馬鈴薯動(dòng)態(tài)發(fā)酵較其靜置發(fā)酵產(chǎn)量高9.1倍。試管定性試驗(yàn)結(jié)果表明，大米固態(tài)發(fā)酵獲得的粗提物，化合物種類最多，麥麩發(fā)酵和動(dòng)態(tài)發(fā)酵次之，馬鈴薯液態(tài)靜置發(fā)酵最少。此外，4種發(fā)酵方式獲得的代謝粗提物對(duì)3株細(xì)胞株的抗腫瘤活性（IC50值）并未呈現(xiàn)明顯差異。研究結(jié)果為該菌株的大規(guī)模發(fā)酵提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 海南粗榧；發(fā)酵方式；內(nèi)生真菌；化學(xué)成分；抗癌活性

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The effect of the different fermentation methods for the endophytic fungus on the yield of secondary metabolites component categories and the cytotoxic activities against the three common leukemia cell lines was investigated. The methods of rice solid-state fermentation， wheat bran solid-state fermentation， potato liquid-standing and potato dynamic fermentation were carried out for CH1307c， which was isolated from phloem of Cephalotaxus hainanensis Li， and culture media were extracted with ethyl acetate. The categories of the crude extractions and their cytotoxic activities against cells K562， NB4 and HL60 were determined by using in vitro qualitative test and MTT test. Compared to the potato dynamic fermentation， the yields of secondary metabolites by rice and bran solid-state fermentation were increased by 45.9 and 28 times， respectively. In addition， the yield of potato dynamic fermentation was higher than its static way with 9.1 times. The results of in vitro qualitative test showed that component species of crude extraction by rice solid-state fermentation was richest， those by wheat bran solid-state and potato dynamic fermentation were second， and that by potato standing fermentation was fewest. Furthermore， the antitumor activities of secondary metabolites of the crude extractions by four fermentation ways towards the three cell lines（concentration of IC50 value）did not exhibit obvious difference. This study provide a theoretical basis to the large-scale fermentation of the strain.

Key words Cephalotaxus hainanensis Li； Fermentation； Endophytic fungi； Chemical composition； Antitumor activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.026

植物內(nèi)生真菌（endophyte）是指可在健康植物組織內(nèi)部穩(wěn)定生活而不引起宿主病變的一類真菌[1]。從其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到的化合物大多具有抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性[2-7]。而菌株產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，除了受合成該產(chǎn)物的基因種類和數(shù)量的制約外，與培養(yǎng)條件也密切相關(guān)[8]。同時(shí)研究證實(shí)，通過改變菌株的生長(zhǎng)微環(huán)境（如培養(yǎng)基質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分、濕度等）可激活菌株的“沉默代謝途徑”，增加菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，從而提高菌種資源的利用率[9]。

OSMAC（one strain-many compounds）策略是提高菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和類別的有效手段[10-12]。Bode等[13]采用該法從6株微生物中獲得了25類100余個(gè)化合物。謝綿測(cè)等[14]僅將煙曲霉培養(yǎng)基由酵母膏蛋白胨葡萄糖改變?yōu)辂溠凯傊?，所獲得的主要化合物便從1個(gè)提高到7個(gè)。液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵是微生物常用的2種發(fā)酵方式，不同的培養(yǎng)基質(zhì)與培養(yǎng)方式對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量以及類型都影響較大，楊寧[8]發(fā)現(xiàn)研究的35株放線菌在固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)下共產(chǎn)生34種次級(jí)代謝產(chǎn)物，是液態(tài)發(fā)酵的2倍。Priyani等[15]發(fā)現(xiàn)Chaetomium chiwersii在同種培養(yǎng)基的液態(tài)培養(yǎng)中主要產(chǎn)生chaetochromin A，而在固態(tài)培養(yǎng)中則主要產(chǎn)生radicicol。因此，在研究?jī)?nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí)，必須考慮不同的培養(yǎng)環(huán)境對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物合成水平的影響。

目前對(duì)內(nèi)生真菌培養(yǎng)方式的研究，普遍做法是選用一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過對(duì)其發(fā)酵條件（如接種量、發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH、添加劑等）進(jìn)行探究，從而達(dá)到優(yōu)化目的[16-17]。而菌株發(fā)酵時(shí)固態(tài)發(fā)酵常以靜置方式、液態(tài)發(fā)酵則以靜置及動(dòng)態(tài)方式，但內(nèi)生真菌在不同基質(zhì)以及不同培養(yǎng)方式中其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成水平的研究較少。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)發(fā)酵合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物總量少且種類有限[18-19]，且對(duì)某些內(nèi)生真菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，其發(fā)酵產(chǎn)物的增加不顯著[20]?？紤]到內(nèi)生真菌原位生態(tài)環(huán)境供氧并不豐富的特點(diǎn)以及動(dòng)態(tài)發(fā)酵應(yīng)用的局限性，本研究擬選用實(shí)驗(yàn)室常用的幾種真菌培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株絲狀真菌進(jìn)行發(fā)酵，通過對(duì)其次級(jí)代謝粗提物的總產(chǎn)量、所合成化合物的類別及其抗腫瘤細(xì)胞活性等幾個(gè)方面進(jìn)行效果評(píng)價(jià)，以尋求更合適的菌株發(fā)酵方式，為后續(xù)的進(jìn)一步分離純化、尋找關(guān)鍵活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與標(biāo)準(zhǔn)品 內(nèi)生真菌細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）CH1307c，由本實(shí)驗(yàn)室分離自海南粗榧韌皮部。高三尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)品（HHT），購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2 癌細(xì)胞株 細(xì)胞K562（人慢性髓原白血病細(xì)胞），細(xì)胞NB4（急性早幼粒白血病細(xì)胞）購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；細(xì)胞HL60（人急性髓原白血病細(xì)胞）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 試劑 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)級(jí)；Iscoves modified Dulbecco medium（IMDM）培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)級(jí)；胎牛血清購(gòu)自Hyclone，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)級(jí)；3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide（MTT）購(gòu)自Amresco，分析純；乙酸乙酯、氯仿、二甲基亞砜、無水硫酸鈉等均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備 電子精密天平PB303-N型，梅特勒-托利多儀；立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5203AA型，上海亞榮儀器設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋YXQ SG41.280型，上海醫(yī)用核子儀器廠；循環(huán)真空泵SHZ-D（III）型，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)CSY-2型，上海凈化設(shè)備廠；全自動(dòng)酶標(biāo)儀SynergyHT型，Bio-Tek；倒置顯微鏡CKX41SF型，OLYMPUS；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器TC10型，bio-Red；雙人單面超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD型，蘇潔凈化；CO2培養(yǎng)箱MCO-175型，SANYO；臺(tái)式低速離心機(jī)TD5M型，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.1.5 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自來水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

大米培養(yǎng)基：大米50 g、自來水25 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

麥麩培養(yǎng)基：麥麩20 g、自來水35 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃滅菌20 min，趁熱搖散[21]。

馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自來水1 000 mL，裝液量100 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

細(xì)胞培養(yǎng)基：含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；含20%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液制備：取經(jīng)活化的CH1307c斜面菌絲一環(huán)至種子培養(yǎng)液中，于28 ℃ 115 r/min的搖床中培養(yǎng)至培養(yǎng)液中清晰可見密集菌絲球，備用。

大米固態(tài)發(fā)酵：取滅菌的大米培養(yǎng)基9瓶，每瓶接種2 mL的種子液，靜置發(fā)酵30 d。

麥麩固態(tài)發(fā)酵：取滅菌的麥麩培養(yǎng)基9瓶，每瓶接種2 mL的種子液，靜置發(fā)酵30 d。

馬鈴薯液態(tài)靜置發(fā)酵：取滅菌的馬鈴薯培養(yǎng)基9瓶，取種子液以2%（V/V）的接種量接種，靜置發(fā)酵30 d。

馬鈴薯動(dòng)態(tài)發(fā)酵：取滅菌的馬鈴薯培養(yǎng)基9瓶，取種子液以2%（V/V）的接種量接種，于28 ℃ 115 r/min的搖床中培養(yǎng)至發(fā)酵液中布滿菌絲球。

將以上4種發(fā)酵方式各設(shè)置3組平行試驗(yàn)，取不接種的各培養(yǎng)基進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物用乙酸乙酯以浸沒分次萃取4次，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物用乙酸乙酯以1 ∶ 1分次萃取4次，靜置萃取間隔12 h，合并4次有機(jī)萃取相，于40 ℃減壓濃縮得浸膏，備用。

1.2.3 化學(xué)成分類別測(cè)定 將各待測(cè)樣品制備后，采用試管法對(duì)各樣品進(jìn)行化學(xué)成分分析，根據(jù)各特定的顏色、沉淀等反應(yīng)特征，判斷該樣品中可能含有的化合物類別[22]。

1.2.4 抗癌活性測(cè)定 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品HHT以及4種發(fā)酵方式獲得的次級(jí)代謝粗提物，用含DMSO（1%；V/V）的PBS溶液配制成系列濃度（1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL），備用。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各細(xì)胞株，將細(xì)胞K562、NB4用RPMI1640培養(yǎng)基分別配制成濃度4×104個(gè)/mL、6×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞HL60用IMDM培養(yǎng)基配置成濃度1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液；以每孔90 μL加至96孔培養(yǎng)板，于37 ℃的CO2（5%）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；以每孔10 μL加入系列濃度的發(fā)酵提取液浸膏以及標(biāo)準(zhǔn)品HHT；繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入三聯(lián)液100 μL；過夜，于570 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定每孔吸光值；每板需設(shè)多個(gè)復(fù)孔的陽(yáng)性對(duì)照以及陰性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按下式計(jì)算抑制率。并計(jì)算IC50值[23]。

抑制率（IR）=（1-待測(cè)樣品OD570值/陰性對(duì)照OD570值）×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±Sd）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式對(duì)內(nèi)生真菌CH1307c次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響

由表1可知，2種固態(tài)發(fā)酵：大米發(fā)酵及麥麩發(fā)酵所得粗提物產(chǎn)量分別為動(dòng)態(tài)發(fā)酵的46.9倍及29.0倍，這可能是由于固態(tài)發(fā)酵更接近內(nèi)生真菌生長(zhǎng)的原生態(tài)，因此固態(tài)較液態(tài)的合成水平高。同時(shí)，對(duì)于該菌株大米較麥麩的產(chǎn)量高，說明該菌株在大米為基質(zhì)的培養(yǎng)環(huán)境中合成水平較麥麩佳。使用液態(tài)發(fā)酵時(shí)，動(dòng)態(tài)方式所得粗提物的產(chǎn)量為靜置方式的9.1倍，這可能是由于靜置發(fā)酵時(shí)菌絲只在培養(yǎng)液表面生長(zhǎng)，無法充分利用營(yíng)養(yǎng)物，而動(dòng)態(tài)發(fā)酵雖然增加了溶氧量，但其菌體與培養(yǎng)基充分接觸，從而發(fā)酵效率提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，影響內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的因素包括供氧及菌株對(duì)培養(yǎng)基的利用率，且供氧的影響較大。

2.2 不同發(fā)酵方式對(duì)內(nèi)生真菌CH1307c次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)成分類別的影響

由表2可知，對(duì)于固態(tài)發(fā)酵，大米發(fā)酵所得的粗提物7類檢測(cè)項(xiàng)目皆為陽(yáng)性，化合物類別最為豐富，而麥麩發(fā)酵所得粗提物中未檢測(cè)到黃酮類化合物。對(duì)于液態(tài)發(fā)酵，動(dòng)態(tài)方式所得粗提物除黃酮6項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目皆為陽(yáng)性，化合物類別較靜置方式更豐富，靜置方式只含酚類、生物堿類、甾體類以及油脂類化合物。

定性實(shí)驗(yàn)雖無法準(zhǔn)確判別該類化合物的存在與否，但未檢出的化合物類別即使存在含量也較低，而低含量的化合物較難分離，不利于后續(xù)研究。對(duì)比4種發(fā)酵方式發(fā)現(xiàn)，大米發(fā)酵最能激發(fā)菌株的“沉默代謝途徑”，提高菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成水平。因此，以化合物種類為指標(biāo)，大米發(fā)酵最優(yōu)。

2.3 不同發(fā)酵方式對(duì)內(nèi)生真菌CH1307c次級(jí)代謝產(chǎn)物的抗癌活性影響

由表3的顯著性分析結(jié)果表明，4種發(fā)酵方式獲得的代謝粗提物對(duì)3種癌細(xì)胞的抑制增殖活性差異顯著，這可能是由于在同濃度下4種發(fā)酵方式獲得的粗提物在成分與類別上的差異，從而造成其抑制效果的不同。但據(jù)表4的IC50值可知，4種代謝粗提物對(duì)K562細(xì)胞的IC50值均大于100 μg/mL，即該菌株由4種發(fā)酵方式獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)K562未表現(xiàn)出抑制增殖活性；4種代謝粗提物對(duì)細(xì)胞NB4、HL60的IC50值均在30～40 μg/mL且并無明顯差異，從IC50可知，由4種發(fā)酵方式獲得的該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)NB4、HL60細(xì)胞均具有較好的抑制增殖作用，推測(cè)是由于4種發(fā)酵方式獲得的代謝產(chǎn)物中，含有相同或相似的成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，該菌株由4種發(fā)酵方式得到的代謝粗提物含有抑制急性白血病細(xì)胞增殖的活性成分，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 討論

本研究結(jié)果表明，4種發(fā)酵方式所獲得的菌株CH1307c的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)3株白血病細(xì)胞的IC50值無明顯差異，說明這4種發(fā)酵方式不影響該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)3種白血病細(xì)胞的抑制增殖作用。但大米及麥麩固態(tài)發(fā)酵獲得的代謝產(chǎn)物，在產(chǎn)量及化合物類別上均顯著優(yōu)于馬鈴薯液態(tài)發(fā)酵。而本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)高活性的海南粗榧內(nèi)生真菌F7進(jìn)行動(dòng)態(tài)發(fā)酵，60 L的發(fā)酵液只獲得了11.6 g的次級(jí)代謝產(chǎn)物浸膏[24]；陽(yáng)暉蓉通過對(duì)海南粗榧內(nèi)生真菌F127進(jìn)行動(dòng)態(tài)發(fā)酵，70 L的發(fā)酵液只獲得15.6 g的次級(jí)代謝產(chǎn)物浸膏[25]；本研究獲得的產(chǎn)量顯然極顯著地提高了內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成水平。這可能是由于液態(tài)發(fā)酵會(huì)抑制該菌株的生化代謝，不利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，而固態(tài)培養(yǎng)的微環(huán)境更接近于內(nèi)生真菌生長(zhǎng)的原生態(tài)，因此更有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累及化合物種類的多樣性[8]。同時(shí)，在工業(yè)生產(chǎn)中，液態(tài)發(fā)酵因所需設(shè)備體積大、費(fèi)用高且易污染等因素限制了其的應(yīng)用，然而固態(tài)發(fā)酵能克服上述不足。因此，固態(tài)發(fā)酵可作為提高該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和多樣性的有效手段。

在本研究中，大米固態(tài)發(fā)酵獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最高且化合物種類最豐富，因此，可選用大米固態(tài)發(fā)酵對(duì)該菌株進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，從而提高該菌株的菌種利用率。同時(shí)，本研究的結(jié)果也表明，選用合適的培養(yǎng)方式能顯著提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成水平，該探索方法同樣也適用于其它內(nèi)生真菌，這對(duì)提高內(nèi)生真菌菌種資源的利用率有重要意義。另外，由于該菌株對(duì)NB4、HL60細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抑制作用，今后將進(jìn)一步對(duì)其抗癌活性的成分進(jìn)行分離純化。

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