甘蔗染色體研究近況

沈姣　王凱　張文盼　董廣蕊　石巖　張積森

摘 要 甘蔗是非整倍性異源多倍體作物，遺傳背景高度復雜，其細胞生物學研究難度大。近年分子標記技術以及原位雜交技術等快速發(fā)展使甘蔗細胞學研究也取得明顯進展。本文主要圍繞甘蔗核型、染色體行為、原位雜交技術在甘蔗上的應用展開綜述，以期為高倍體植物細胞學研究提供參考。

關鍵詞 甘蔗；多倍體；染色體；原位雜交技術

中圖分類號 TQ352 文獻標識碼 A

Abstract Sugarcane is an euploid allopolyploidy with complex genetic background， its cytological study was thus considered to be challenging. In these years，significant progresses for the cytology of sugarcane have been made based on the rapid development of molecular marker technology and in situ hybridization. Here， to provide the reference for cytological study in high polyploidy plant， we reviewed the germplasm resources， karyotype， chromosome behavior， and in situ hybridization technique for sugarcane.

Key words Sugarcane； Olyploidy； Chromosome； In situ hybridization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.030

甘蔗（Saccharum officinarum）屬是禾本科甘蔗亞族中10個屬之一，與蔗茅屬（Erianthus）、芒屬（Miscanthus）、河八王屬（Narenga）組成“甘蔗屬復合體（Saccharum Complex）”。甘蔗屬主要包括6個成員，熱帶種（S. officinarum L.）、中國種（S. sinense Roxb.）、印度種（S. bareri Jesw.）、割手密（S. spontaneum L.）、大莖野生種（S. robustum Brandes and Jeswiet ex Grassll）和食穗種（S. edule Hassk）[1]，前三者為栽培種，其余為野生種。

甘蔗是一種以非整倍性和多倍性而著稱的多年生熱帶亞熱帶作物，作為一種C4植物，甘蔗能高效將太陽能轉化為化學能，是工業(yè)生產上較高的能源作物之一。因此，對甘蔗開展進一步研究具有重要意義。但是甘蔗染色體數目多，形態(tài)相似，壓片技術難以把握、遺傳背景復雜等困難給研究工作帶來了極大的挑戰(zhàn)，一直以來取得的科研成果難以給后來研究者提供可靠的依據，因此，甘蔗細胞學的研究特別是分子水平的研究難以取得突破性的進展。本文綜述了近幾十年來甘蔗核型、染色體行為、原位雜交技術在甘蔗上應用的研究近況，期望為甘蔗分子生物學研究乃至多倍體作物細胞生物學研究工作提供理論參與。

1 甘蔗染色體核型

1.1 核型概況

栽培種甘蔗是異源雜合非整倍體作物，染色體數目較多（一般2n>100），形態(tài)小、相似性較高，因此，對精確分析甘蔗核型的工作帶來了挑戰(zhàn)，隨著過去20 a許多科研工作者對甘蔗研究的不斷努力，在甘蔗染色體形態(tài)、大小、數目、基因結構、進化等諸多方面有了初步了解。甘蔗染色體大小為1～6 μm左右，屬于禾本科植物中較小的染色體，且不同染色體的大小非常接近，不易辨認[2-3]。甘蔗染色體大多數為中部著絲點（m）染色體，少部分為近中部著絲點（sm）染色體，核型大部分為2B型，甘蔗近緣種斑茅為1A型染色體[4]，根據Stebbins[5]植物染色體核型按對稱性程度高低分類（1A、2A、3A、4A；1B、2B、3B、4B；1C、2C、3C、4C）標準，甘蔗屬以及近緣屬染色體都屬于較原始的核型。上述研究結果還表明了隨著祖親代野生種向高世代雜交栽培種的演化，表現出一致的特征：隨著雜交次數及祖親血緣的不斷增加，染色體數目將按一定的方式增加，中部著絲點染色體所占比例逐漸減少，核型從對稱向不對稱方向演化，基本符合物種進化趨勢。

1.2 異染色質與物種進化研究

甘蔗屬的染色體異染色質程度高低不同。對甘蔗3個品種Giemsa-C帶分析表明：割手密野生種和熱帶種異染色質程度較低，中國種異染色質含量高[6]。據有關報道[7]高等生物異染色質含量多少與物種進化程度高低有關，所以中國種應該是進化程度較高的物種，割手密是進化上較為原始的物種。同時莊偉建對甘蔗4個種十多份材料進行了染色體形態(tài)學研究，其中割手密和熱帶種的染色體較對稱，而中國種和印度種的染色體較不對稱[6]，即印度種和中國種進化程度較高。盡管沒有直接的證據，大家一般認為食穗種是熱帶種或大莖野生種與近緣屬種雜交而來，加上一直以來都假定大莖野生種是熱帶種的祖先，以及大莖野生種可能由割手密種和蔗茅屬、硬穗茅屬和芒屬發(fā)生基因滲透進化而來[8]，Waldrona和Glaszioud[9]的酯酶同工酶分析支持割手密作為甘蔗進化起點，以上論點可作為推測甘蔗屬中6大種進化程度關系的依據。

1.3 染色體數目探索

染色體是遺傳物質的主要載體，染色體數目的變化與表現型的變異關系密切。觀察作物的染色體已成為作物育種和細胞遺傳的重要研究手段。甘蔗染色體數目多，并且品種之間染色體數目變化幅度大，即使同一品種在不同組織或不同生育期，觀察到的染色體數目也不盡相同[10]。下面將具體介紹甘蔗不同種屬的染色體數目情況：

熱帶種（S. officinarum L.），較早開始甘蔗研究工作的Bremer博士和Sreenivasan博士確認了熱帶種的染色體數目為2n=80，當初也發(fā)現了染色體數目不是2n=80的無性系，他們認為此類無性系可能是雜種。隨著分子細胞學技術的發(fā)展，這一推測逐漸被證實[11-12]。

割手密（S. spontaneum L. SES），染色體數目分布廣泛，倍性水平多（2n=40～128，五倍體、六倍體、八倍體、九倍體、十倍體等），同時也是甘蔗屬中擁有最少染色體數的種（2n=40）。據我國甘蔗研究人員[13-15]的考察和鑒定，割手密的染色體數目，具有2n為40、48、56、60、64、72、80、96、l04、l08、128等多種不同類型。2n=64、80和96 3種細胞類型出現的頻率較高。來自云南、四川、福建、廣東、貴州、江西6個省份的106份甘蔗野生種割手密無性系染色體數目的變化，預示由南向北，隨著緯度的增高、海撥的變化，割手密的染色體數目在增加，染色體類型在擴大[15]。造成如此多種類型的原因可能是由于割手密無性系不同類型間的花期常相互連接，雜交機會多，產生多種類型的天然雜種。

大莖野生種（S. robustum Brandes and Jeswiet ex Grassll）的染色體數目為2n=60、80[16]，染色體數目通常不變。印度種和中國種的染色體數目卻不固定，印度種的染色體數變動在82～124之間，而且這種變動似乎與其地理分布有一定聯系；中國種的染色體數則變動在115～123之間。更為詳細的細胞學研究還顯示，印度種和中國種不僅不同無性系染色體數目不同，甚至同一無性系內細胞與細胞之間的染色體數目也都是變化的，減數分裂時染色體數目的變異則更大。

據報道，蔗茅屬（Erianthus）各個種的染色體數目有2n=20、22、24、30、40、60，其中斑茅的染色體數可以為2n=20，40，60[13]。芒屬（Miscanthus Anderess）其各個種的染色體數在2n=38～141之間，硬穗屬（Sclerostachy A. Camus）染色體數為2n=30或34，河八王屬（Narenga Bor.）染色體數為2n=30。

甘蔗以莖進行無性繁殖過程中，體細胞染色體數目的變化會發(fā)生累積。當染色體數目增減變化累積到一定程度時，必然會引起遺傳結構及其所決定的重要農藝性狀的變異，這可能是甘蔗品種在生產上應用無性繁殖技術一段時間后，農藝性狀變差（品種退化）的細胞遺傳學原因之一[17]。因此，在甘蔗育種和生產應用時，選擇細胞周期相對一致的雜交親本對培育和保持新品種的優(yōu)良特性至關重要。

1.4 染色體基數的確定

對于多倍體物種而言，染色體基數是指單一染色體組內所含有的染色體數目，以x表示。對于甘蔗屬基本染色體數目的確定經歷了很長一段時間的推導，1991年以前，大家公認為甘蔗屬和須芒草屬一樣，基本染色體數為10[18]，隨著最小染色體數2n=40的割手密種的發(fā)現，打破了基本染色體只有10的這一觀點。目前有研究人員認為甘蔗屬基本染色體數應該為x=5，8，10[19]，也有人認為是x=10，12[20]，Bremer[21]則指出甘蔗屬有3個基本染色體數目x=6，8，10。因此，甘蔗屬不同群體的多倍性系列以及基因組的平行進化2個因素導致了基本染色體數的不同[3]。隨著原位雜交技術的出現，利用45S rDNA基因和5S rDNA基因作為確定甘蔗染色體基數的工具，驗證了割手密染色體基數為8[22]，大莖野生種、熱帶種和蔗茅屬的染色體基數為10[23-24]，芒屬單倍體染色體數為19。

2 甘蔗染色體的遺傳行為

2.1 減數分裂中的染色體配對

減數分裂過程中的染色體配對是細胞生物學的一項重要特征，因為染色體的配對行為是染色體間同源關系和進化歷程的體現。盡管甘蔗的高倍性水平，但主要還是以二價體配對為主，單價體三價體出現較少[25]。這就與認為甘蔗是一種異源多倍體的傳統(tǒng)觀念是相違背的，因為異源多倍體是嚴格的二價染色體配對，當然也不是嚴格的同源多倍體配對模式，而是一種協調的多倍體配對模型，即既有異源多倍體染色體配對行為又有同源染色體配對行為，這種協調模型廣泛存在多倍體物種中[26]。通過對連鎖圖上分子標記在分斥相分離情況的剖析，能夠清楚地鑒定減數分裂時染色體的配對行為。在對SES 208[27]和SES 147B[28]這2種割手密進行連鎖群構建時，沒有出現分斥相，即每條染色體可以自由和另外7條同源染色體配對。熱帶種8個連鎖群和大莖野生種的7個連鎖群則表現出偏好配對[29]。目前為止，在甘蔗減數分裂過程中占主導方向的仍是偏好配對[30]，且時常會表現出不同的配對親和力[26]。

2.2 減數分裂行為解釋2n配子的形成

正常減數分裂產生的是單倍體配子（n），減二后期會觀察到四分體，不正常減數分裂則會形成二倍體配子（2n），在顯微鏡下看到的則是二分體或者三分體。無論是雜交種還是純種都會產生二分體和三分體，但是這2種形式在雜交種中出現的頻率要明顯高于純種；純種品系中，熱帶種相對于割手密會更容易產生2n配子。從分子水平上來分析，是由于在雜交種中，調節(jié)染色體聯會和分離的基因更容易丟失[25]，在細胞學上表現為染色體缺失、片段化和丟失等[31-32]。這些調控基因一旦丟失，基因組內的遺傳調節(jié)因子就會混亂互作，從而導致非整倍體以及2n配子的產生。遺傳調節(jié)因子混亂互作致使減數分裂行為不正常，包括后期橋的形成，染色體分裂滯后，分裂不同步，胞質不分離等，主要機制有4種：第一次分裂后復原（First division restitution，FDR）；第二次減數分裂后復原（Second division restitution，SDR）；大孢子四分體融合（Megaspore tetrad cell fusion，MTCF）和減數分裂后復原（Post-meiotic restitution，PMR）。在其他植物中，前2種機制占主導地位[33]。而在甘蔗中，大孢子分裂過程是一個連續(xù)的過程，因此，在甘蔗中就不可能用FDR也不能用紡錘絲未形成去解釋2n的形成[25]，Bremer等[34]在種植甘蔗時發(fā)現，雖然有少數SDR的例子，但是常見的卻是PMR機制。用一系列分子標記技術去追蹤減數分裂過程時，認為SDR/MTCF更能解釋2n配子產生現象[35]。然而，對甘蔗2n配子形成機制的了解還處在初步探索階段，沒有統(tǒng)一定論。

3 原位雜交技術及其在甘蔗上的應用

原位雜交（in situ hybirdization）技術是一種把核酸分子雜交技術與組織學定位相結合的DNA分子標記技術，具有特異性強、靈敏度高、定位準確等特點[36]。該項技術已廣泛應用于動物基因組重復序列、單拷貝或多拷貝基因家族的染色體定位、雜種親本染色體的鑒定、染色體的結構分析、外源染色質檢測、物種進化及親緣關系與染色體物理圖譜構建等的研究。但在植物染色體上的應用受到植物細胞壁的屏蔽作用、細胞質的覆蓋影響，使得植物熒光原位雜交技術的染色體制片環(huán)節(jié)相當困難。尤其是數目多又變化較大的甘蔗染色體，使得原位雜交技術在甘蔗上的應用起步較晚。

3.1 原位雜交技術在甘蔗上的應用

3.1.1 基因定位研究 甘蔗染色體基因定位具有顯著成效的工具當屬rDNA，主要是45S rDNA基因和5S rDNA基因。用45S rDNA基因標記為探針分別與熱帶種、大莖野生種和割手密染色體進行原位雜交，結果探針被定位于熱帶種和大莖野生種染色體末端、割手密染色體次縊痕處，而5S rDNA基因在各物種中的位置與45S rDNA基因定位情況完全不同，熒光原位雜交技術檢測出5S rDNA信號位于熱帶種和大莖野生種染色體縊痕處、割手密的染色體間質區(qū)[2-3]（圖1）。5S rDNA在2n=96的Mandalay和2n=112的Glagah 2個割手密種上可檢測出12和14個信號點，然而，在進行45S rDNA定位時卻只出現10和12個信號位點，且其中5個信號很微弱，幾乎難以檢測到。信號強弱反映了45S rDNA在各個染色體上拷貝數的不同[2]。45S rDNA位點缺失這一推理近年來在其他多倍體物種上得到了驗證[37-38]。Arrighi[39]甚至還提出在多倍體進化過程中物種通過染色體畸變的方式，主要是基因的缺失，去維持恒定的45S rDNA位點數目，從而導致位點數與倍性水平不一致，相反5S rDNA位點卻與倍性水平具有明顯的相關性，且5S rDNA在染色體上分布模式不一，在不同染色體上的拷貝數也存在較大的差異。

3.1.2 基因組結構的分析 現代栽培甘蔗是熱帶種（S. officinarum L.）與割手密（S. spontaneum L.）雜交后，還經過了少于八代的雜交[35]，從而使其基因組結構復雜，甘蔗基因組比其他任何多倍體都要復雜。以前，大家都認為2個親本之間沒有染色體重組[40-41]。GISH技術清晰證明了現代甘蔗栽培種大約有 70%～80%的染色體來自于熱帶種，10%～23%全部來自于割手密，另外5%～17%來源于熱帶種和割手密的重組[12，42]。20世紀90年代以前，對于印度種和中國種基因結構組成的看法很多[8，43]，D'Hont[44]反復驗證了印度種和中國種是熱帶種和割手密的雜交種，其中并沒有檢測出其它種質?？梢?，基因組熒光原位雜交（GISH）這項分子細胞遺傳學技術是一種研究復雜多倍體基因組結構直接有效的方法，將為其他未知多倍體基因組結構的分析提供有力工具。

3.1.3 染色體傳遞方式的確定 由于甘蔗屬多為異源多倍體植物，其染色體組成及傳遞方式較為復雜和獨特。有性雜交過程中，親子代染色體傳遞往往不符合經典的細胞遺傳規(guī)律，而是表現出多種染色體傳遞方式：n+n，2n+n，n+2n，2n+2n[12，45]。通常情況下，熱帶種與割手密的雜交規(guī)律為：熱帶種傾向于產生2n配子，割手密形成n配子，即F1染色體傳遞方式為2n+n[46]；BC1代染色體傳遞方式大體上為2n+n，BC2代為n+n[21]，驗證了當雙親中都含有割手密染色體時，n+n傳遞方式起主導作用[47]。熱帶種與中國種和現代栽培種雜交時子代也表現出2n+n的遺傳方式[12]。然而熱帶種與甘蔗其他種屬的雜交情況卻截然不同，熱帶種與熱帶種雜交或者與大莖野生種雜交時，染色體的傳遞方式為n+n[46，48]。甘蔗屬與甘蔗近緣種屬斑茅雜交的F1和BC2（BC1×商品蔗）代中，染色體傳遞方式為n+n，BC1（F1×商品蔗）代中則是2n+n[45，49]，而其中2n和n常常不是體細胞、配子原來數目，常有增減，即存在“不平衡”現象[50]，體現了甘蔗染色體傳遞方式的復雜性。甘蔗有性雜交過程中，一個比較明顯的趨勢就是父本給后代總是傳遞n配子，這是一種在遠緣雜交不親和性引導下的一種母本保護機制，即阻止外來遺傳物質進入母本[32]。

3.1.4 染色體結構變異現象的發(fā)現 親本在傳遞2n和n配子過程中，常常少于體細胞、配子原來數目，這其實與染色體的丟失有關[31]。利用FISH技術在甘蔗屬與斑茅的雜交子代中不僅清晰看到了染色體的丟失[42，51]，而且發(fā)現了甘蔗屬與斑茅之間的染色體重組現象[32，52]。常見的一種染色體重組方式就是易位，黃永吉[49]研究表明在甘蔗屬與斑茅的BC1、BC2和BC3子代染色體中都存在易位，且分為2種主要的易位形式：S/E型，這種染色體由包括甘蔗屬著絲粒的大部分和斑茅端部染色體片段構成；相反，E/S型，就是包括斑茅著絲粒的大部分染色體和甘蔗屬部分端部染色體組成的染色體類型。易位這種染色體變異可以穩(wěn)定遺傳給后代，這就為新生遺傳型和表型的產生提供可能。王先宏[32]田間試驗發(fā)現，雜交子代的各種農藝性狀都超過了親本，如：生長速率、株重、蔗桿直徑、蔗糖產量等，這可能與斑茅染色體缺失和丟失不利基因以及染色體重組產生的雜交優(yōu)勢有關，這將為甘蔗育種事業(yè)帶來深遠影響。

染色體結構改變也能為物種進化提供可能。通過甘蔗遺傳圖與高粱基因組的共線性分析[53，54]，得出在2個物種分化后，甘蔗發(fā)生了多次染色體重組事件，其中2次主要重組事件對甘蔗物種的形成產生了重要的影響，一是Sb2（高粱二號染色體，下同）和Sb8組成甘蔗同源群HG8，Sb5和Sb6變成同源群HG2，即原來對應高粱的2號和8號染色體融合成甘蔗的一條染色體，5、6號染色體融合成另一條染色體，因此在高粱中染色體基數X=10，慢慢演化成了染色體基數為X=8的割手密。在甘蔗近緣屬芒屬（Miscanthus sinensis.）中也出現類似的情況：芒屬和高粱分開后，兩條染色體融合成一條染色體，染色體數目減少到x=19[55]。2條染色體通過相互間染色體易位融合成一條染色體的過程，在禾本科植物中出現得比較多[56-57]。巨大的染色體結構變異也許解釋了割手密的不同倍性水平、地理分布范圍廣泛的由來，以及甘蔗屬、甘蔗近緣屬能適應各種生物和非生物脅迫環(huán)境的原因。

著絲粒由DNA和蛋白質組成，是真核生物有絲分裂和減數分裂過程中染色體正確分離和傳遞所必需的染色體區(qū)域，雖然著絲粒的功能非常保守，但真核生物各物種的著絲粒DNA序列卻高度變異，相比之下，著絲粒蛋白在物種間則相對保守，發(fā)揮功能的蛋白主要是CENH3，Nagaki[58-59]推導出甘蔗的氨基酸序列與玉米水稻著絲粒蛋白CENH3序列極為相似，因此用水稻的CENH3抗體去與甘蔗的SoCENH3進行免疫共沉淀（ChIP），分析沉淀下來的DNA序列信息，得出甘蔗的SoCENH3中有140 bp的串聯重復序列（SCEN）和甘蔗逆轉座子重復（CRS）序列，這2種序列都表現出著絲粒特異性，雜交信號大小不一，CRS信號比SCEN信號多且強。由此說明甘蔗著絲粒重復序列包含串聯重復和逆轉座子重復，SCEN家族和CRS家族序列變化大，并且其中大部分是逆轉座子重復。

3.1.5 甘蔗著絲粒組成 甘蔗基因組測序是目前甘蔗分子生物學基礎研究的重要攻關點。而甘蔗基因組的復雜性以及廣泛存在的重復序列尤其是著絲粒上的串聯重復和逆轉座子重復，必將阻礙甘蔗全基因組測序中用BACs克隆進行的重疊群（contig）組裝，加之，自動化組裝無法填補重疊群之間的間隔。然而，高分辨FISH細胞學技術卻可以確定不同克隆之間的排列順序，還可以用于估算在同一染色體上重疊群間間隔的長度，定量分析不同克隆之間的重疊程度和實際距離，從而實現重疊群的組裝，逐步完成甘蔗全基因組測序工作。

4 展望

本文從甘蔗染色體核型、甘蔗染色體遺傳行為以及原位雜交技術在甘蔗上的應用3個方面簡單綜述了甘蔗染色體研究近況，對甘蔗分子生物學和多倍體作物細胞生物學研究工作提供了一定的理論基礎。

甘蔗染色體的異質性、多倍性、非整倍性、減數分裂不規(guī)則、染色體傳遞方式的復雜性等因素制約著甘蔗細胞學的發(fā)展。要想進一步了解甘蔗細胞學特征，得尋求新的技術支持，FISH則是細胞遺傳學上具有里程碑式意義的一項技術，可望克服甘蔗細胞學研究中遇到的困難，使我們能夠了解甘蔗染色體結構細節(jié)，分析基因組結構，并加速對甘蔗遺傳和進化機制等領域的了解，從而進一步推動甘蔗遺傳育種改良進程，促進甘蔗生產發(fā)展。

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