胡椒PnNPR1基因的克隆與表達(dá)分析

范?！『鲁\(yùn)　胡麗松　伍寶朵　鄔華松

摘 要 根據(jù)胡椒病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes1， NPR1）基因的部分序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用RT-PCR方法獲得其家族成員的1個(gè)全長(zhǎng)cDNA，命名為PnNPR1，長(zhǎng)度1 712 bp，開放閱讀框1 362 bp，編碼454個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè) PnNPR1分子量為141.56 ku，理論等電點(diǎn)為4.98。該基因含有BTB/POT結(jié)構(gòu)域、ANK錨蛋白重復(fù)序列、DUF和NPR1-like C等4個(gè)結(jié)構(gòu)域，具有植物NPR1所共有的保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，PnNPR1與苜蓿的同源性最高。Real-time RT-PCR 結(jié)果表明，PnNPR1在胡椒葉片、根、莖和花中均表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最高。辣椒疫霉菌誘導(dǎo)后，PnNPR1基因的表達(dá)量在抗/感2種胡椒中均出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，并且在抗病種質(zhì)中表達(dá)量較高。研究結(jié)果為PnNPR1的功能研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 胡椒；病程相關(guān)基因非表達(dá)子1；克隆與表達(dá)

中圖分類號(hào) S573 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The full-length cDNA encoding Nonexpressor of pathogenesis-related genes1（NPR1）， designated as PnNPR1， was isolated from black pepper by using PCR. The sequence of PnNPR1 was 1 712 bp in length， containing a 1 362 bp open reading frame， and encoding a polypeptide of 454 amino acids with a calculated molecular weight of 114.56 ku and a pI of 4.98. The protein had four conserved domains of BTB/POT， ANK anchored protein repeat sequences， DUF and NPR1-like C. The phylogenetic analysis showed that PnNPR1 had a closer relationship with Medicago truncatala. Real time quantitative PCR analysis showed that the expressions of PnNPR1 were differentially expressed in the root， stem， leaf and flower of black pepper. When P. capsici infected， PnNPR1 was significantly higher in resistant germplasm than in susceptible germplasm， and all time point of expression of PnNPR1 were up-regulated by infected. This result would generate an important theoretical and practical significance for black pepper genetic improvements.

Key words Black pepper； Nonexpressor of pathogenesis-related genes1（NPR1）； Cloning and expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.013

胡椒（Piper nigrum）具有重要的藥用和工業(yè)價(jià)值，是世界最重要的香辛作物之一[1-3]。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，世界胡椒收獲面積5.53×105 hm2，總產(chǎn)量達(dá)4.33×105 t，其中中國(guó)胡椒主要分布在海南、云南、廣東和廣西等地，年產(chǎn)量2.72×104 t，位居世界第五[4]。隨著胡椒新功能的不斷挖掘和人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，中國(guó)對(duì)胡椒的需求量還將大幅增加。目前中國(guó)主栽品種為熱引1號(hào)（P. nigrum c.v. Reyin-1），又稱印尼大葉種，中感胡椒瘟病，生產(chǎn)上仍采取預(yù)防為主、綜合防治為輔的措施，大大增加了種植生產(chǎn)成本[5]。胡椒主栽品種抗瘟病能力差已成為限制中國(guó)胡椒種植面積進(jìn)一步擴(kuò)大的重要因素，威脅著胡椒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，因此選育適合中國(guó)氣候環(huán)境特點(diǎn)的高產(chǎn)、高抗新品種是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要。

轉(zhuǎn)基因育種可定向改良特定性狀，縮短育種周期，是培育作物新品種的重要手段。長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)的作物育種技術(shù)為雜交、誘變育種，但存在育種周期長(zhǎng)、選擇準(zhǔn)確性差、育種效率低等缺點(diǎn)，特別是應(yīng)用于多年生木本植物時(shí)更加明顯。轉(zhuǎn)基因技術(shù)既可在受體中表達(dá)受體的同源基因，也能打破物種限制，在受體中表達(dá)來(lái)自于不同受體的外源基因，從而達(dá)到定向改良某一或某些性狀的目的[6]。病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes1， NPR1）是植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因。NPR1基因是植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控基因，激發(fā)植物防御機(jī)制產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，增加防御反應(yīng)強(qiáng)度和速度，使植物具有廣譜抗病性[7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家較為系統(tǒng)地研究了NPR1基因包括NPR1基因的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理、在植物抗病中的作用，預(yù)測(cè)在抗病育種中的應(yīng)用前景等。自1994年首次從擬南芥分離得到NPR1基因，并陸續(xù)轉(zhuǎn)入到不同類型作物中。2001年，Park等[8]將擬南芥NPR1基因超表達(dá)載體導(dǎo)入到水稻中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)細(xì)菌性枯葉病原體（X00）的抗性提高了，通過RNA點(diǎn)雜交發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株抗病性的提高是因?yàn)镹PR1基因的高表達(dá)，首次證明了NPR1基因可以提高單子葉植物抗病性。同樣，在一些重要的經(jīng)濟(jì)作物中如煙草、油菜、西紅柿、甘藍(lán)、椰菜、馬鈴薯、玉米、小麥發(fā)現(xiàn)同源基因，并且其調(diào)控機(jī)制基本一致[9-10]。大量研究表明，轉(zhuǎn)NPR1基因可提高轉(zhuǎn)基因作物對(duì)部分真菌和細(xì)菌的抗性，具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。但是，目前還沒有關(guān)于NPR1基因在胡椒中的克隆與表達(dá)研究。

本研究擬通過RT-PCR法從胡椒中克隆NPR1抗病關(guān)鍵基因，分析其表達(dá)模式，為今后胡椒遺傳改良、轉(zhuǎn)基因育種等提供重要依據(jù)，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 試驗(yàn)材料熱引1號(hào)胡椒來(lái)自胡椒標(biāo)準(zhǔn)化種植示范園，為中國(guó)主栽品種，中感胡椒瘟??；黃花胡椒（Piper flaviflorum）來(lái)自農(nóng)業(yè)部胡椒種質(zhì)資源圃，為栽培種的野生近緣種，中國(guó)特有物種，主要分布在云南東南和西南部，高抗胡椒瘟病。切取健壯無(wú)病蟲害的當(dāng)年生主蔓，修剪成長(zhǎng)度約40～60 cm、具4～7節(jié)和6～12片葉的扦插苗，采用沙培法植于溫室中，待生根后進(jìn)行針刺接種。將辣椒疫霉菌孢子用無(wú)菌水稀釋至每毫升約5×106個(gè)，用于針刺接種?？?感種質(zhì)材料種苗均分為2組，按照如下方式進(jìn)行：一組材料作為接種組，每個(gè)苗針刺3次；另一組作為對(duì)照組，用無(wú)菌水替代病原孢子液，同方法針刺接種。針刺處理在30 min內(nèi)完成。根據(jù)Panstruga等[11]研究，接種后48 h 內(nèi)是病菌孢子萌發(fā)、侵染以及植物體內(nèi)受體識(shí)別侵染信號(hào)并做出反應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)期，因此接種組取樣時(shí)間為未處理即0 h，以及處理后的8，12和24 h，分別取接近主蔓的根部組織用于后續(xù)試驗(yàn)。取樣后立即投入液氮中，并迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑及核酸測(cè)序 RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，逆轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α菌株購(gòu)自TaKaRa公司，SYBR Green qRT-PCR試劑盒購(gòu)自伯樂有限公司，核酸測(cè)序和引物合成委托上海英駿生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 參照試劑盒方法提取總RNA。取2 μg RNA樣品根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.2 胡椒NPR1基因的克隆 搜索胡椒EST數(shù)據(jù)庫(kù)（SRS856941），根據(jù)CL4128.Contig2_F0463-PN序列設(shè)計(jì)引物CL4128-F-S和CL4128-F-A（表1），以胡椒根部組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，30個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min）72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物（基因片段A）回收后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.3 胡椒PnNPR1序列的生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站中的BlastX對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化分析選取同源性>30%的序列進(jìn)行。蛋白理化性質(zhì)分析利用Protparam在線分析軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行，用Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)分析氨基酸序列的功能域，預(yù)測(cè)蛋白是否存在信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位使用PredictProtein工具（https：//www.predictprotein.org/），用SPORT軟件（http：//psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，用PHD工具分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用DNAman軟件構(gòu)建同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 PnNPR1定量PCR分析 以PnHistone3基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ進(jìn)行定量PCR分析，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，所有的樣品數(shù)據(jù)分析，相關(guān)基因的表達(dá)使用2-△△CT方法定量，結(jié)果為平均值±SD。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，定量比較采用t檢驗(yàn)方法，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PnNPR1基因cDNA序列的克隆

基于已獲得的胡椒EST序列片段，在目的基因的5′端和3′端設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出目的基因，獲取2 kb左右片段。去除載體序列，該基因全長(zhǎng)1 712 bp，包含一個(gè)1 362 bp的完整開放閱讀框，編碼454個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，5′端非編碼區(qū)326 bp，3′端非編碼區(qū)32 bp，推測(cè)的氨基酸與核酸序列見圖1。

2.2 生物信息學(xué)分析

PnNPR1蛋白的分子式為C5 212H8 714N1 712O2 198S344，編碼454個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為141.56 ku，等電點(diǎn)為4.98，理論推導(dǎo)半衰期大于10 h，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白中相對(duì)含量比較多的氨基酸是Thr（485個(gè)，28.3%）、Ala（474個(gè)，27.7%）、Gly（409個(gè)，23.9%）、Cys（344個(gè)，20.1%），Pyl和Sec的含量為0?？偟膸ж?fù)電荷的殘基（Asp+Glu）和正電荷的殘基（Arg+Lys）均為0，親水性平均數(shù)為0.707，預(yù)測(cè)該蛋白為水不溶性蛋白。根據(jù)SPORT軟件分析結(jié)果，預(yù)測(cè)該基因主要分布在細(xì)胞核（47.8%）和細(xì)胞質(zhì)（34.8%）中，無(wú)信號(hào)肽。NCBI對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析表明，該基因含有ANK錨蛋白重復(fù)序列、BTB/POT結(jié)構(gòu)域、DUF和NPR1-like C等4個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖2）。

蛋白質(zhì)多肽鏈通常折疊和盤曲成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與其特定生物學(xué)功能密切相關(guān)。常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)有α-螺旋（α-helix）、β-折疊（β-pleated sheet）、β-轉(zhuǎn)角（β-turn）、無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）、延伸鏈（extend strand）等。PHD軟件分析表明，PnNPR1主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，3種結(jié)構(gòu)所占比例分別是60.49%，25.17%和7.73%（圖3），可見α-螺旋是PnNPR1最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

從NCBI網(wǎng)站上獲取其他作物的NPR1氨基酸序列，將PnNPR1氨基酸序列與其它植物的NPR1比較，發(fā)現(xiàn)PnNPR1與苜蓿（Medicago truncatula）、葡萄（Vitis vinifera）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）等作物的NPR1家族成員的同源性分別達(dá)到63.4%，46.4%，46.2%和46%（圖4）。構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，PnNPR1最先與苜蓿NPR1聚合；與番茄、葡萄、楊樹、大豆序列進(jìn)化距離均較遠(yuǎn)，推測(cè)這種現(xiàn)象可能與物種起源地有關(guān)，同時(shí)胡椒是基部被子植物中最大的屬之一，屬于傳統(tǒng)的木蘭亞綱（圖5）。

2.3 PnNPR1的表達(dá)模式分析

以histone3為內(nèi)參，用real-time PCR方法分析PnNPR1表達(dá)模式。結(jié)果顯示，PnNPR1在熱引1號(hào)胡椒不同組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平從高到低依次為葉、莖、根、花（圖6）。

以病原菌侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的根部cDNA為模板進(jìn)行qPCR分析來(lái)研究PnNPR1基因的表達(dá)特征，結(jié)果表明：在處理前，黃花胡椒與熱引1號(hào)胡椒的PnNPR1表達(dá)量均較低，辣椒疫霉菌誘導(dǎo)后，PnNPR1基因的表達(dá)量在2種種質(zhì)中都明顯增加，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢(shì)；處理后12 h表達(dá)量達(dá)到最大，隨后開始下降，并且，所有處理時(shí)間下，黃花胡椒的表達(dá)量均大于熱引1號(hào)胡椒（圖7）。

3 討論與結(jié)論

項(xiàng)目組前期研究中獲得了一個(gè)與NPR家族蛋白具有高度同源性的EST特異序列[12]，根據(jù)此序列從胡椒中克隆得到一個(gè)NPR1基因，將其命名為PnNPR1。對(duì)該基因進(jìn)行生物學(xué)信息分析，預(yù)測(cè)該蛋白為水不溶性蛋白，主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，研究表明NPR1功能發(fā)揮非常必要的條件就是核定位特性[13]，NPR1蛋白在非誘導(dǎo)狀態(tài)下通常以多聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，一旦發(fā)生SAR誘導(dǎo)，NPR1蛋白氧化為單體并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，與多種TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用并激活PR基因表達(dá)，最后導(dǎo)致植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)[14]。PnNPR1基因同時(shí)具有植物NPR1所共有的保守結(jié)構(gòu)域，其中BTB/POT結(jié)構(gòu)域、ANK錨蛋白重復(fù)序列這2個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)PR1基因發(fā)揮其功能極為重要，同時(shí)涉及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，前期對(duì)這些區(qū)域高保守的氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變的結(jié)果驗(yàn)證了這一說法[15-17]。另有研究表明NPR1基因與TGA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的必要元件是ANK結(jié)構(gòu)域，正向調(diào)控PR基因表達(dá)，使植物產(chǎn)生SAR[18]，推測(cè)NPR1可能通過與其它蛋白的相互作用參與調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)反應(yīng)。

本研究中，接種辣椒疫霉菌后不同時(shí)間下，PnNPR1基因在根、莖、葉和花中均有表達(dá)，且表達(dá)存在明顯差異，其中葉片中的表達(dá)量最高，花的表達(dá)豐度最低。這與荊州黑麥ScNPR1基因的表達(dá)相似，均在葉中表達(dá)量較高，而擬南芥AtNPR1基因、水稻OsNPR1基因均無(wú)組織特異性表達(dá)，推測(cè)NPR1組織特異性表達(dá)可能與不同物種有關(guān)。

NPR1是SAR的一個(gè)中心元件，表達(dá)在PR基因之前，但在SA積累之后阻止SAR信號(hào)的發(fā)生[19]。NPR1基因在正常植株中有少量表達(dá)，當(dāng)用SA或INA處理[20]或病原菌侵染時(shí)[21]，其表達(dá)量可提高大約2～4倍，本研究發(fā)現(xiàn)胡椒PnNPR1基因在辣椒疫霉菌侵染下表達(dá)量都升高，且不同時(shí)間段其表達(dá)差異顯著，在12 h下到達(dá)最高值，產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能是因?yàn)镻nNPR1的轉(zhuǎn)錄受到病原菌的反饋機(jī)制調(diào)節(jié)，使蛋白維持在一定的水平，進(jìn)一步說明了PnNPR1基因調(diào)控胡椒瘟病及信號(hào)傳導(dǎo)中的重要作用。研究同時(shí)顯示，將從水稻中克隆的OSNPR1基因在水稻中高表達(dá)，能夠提高該作物對(duì)白葉枯病和稻瘟病的抗性[22]；從抗黃枯萎病海島棉克隆獲得GbNPR1基因，將其轉(zhuǎn)入到煙草中，可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)赤星病菌的抗性，且其轉(zhuǎn)錄水平受棉花黃萎病原菌誘導(dǎo)[23]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，胡椒抗病種質(zhì)（黃花胡椒）與感病種質(zhì)（熱引1號(hào)胡椒）受辣椒疫霉菌侵染后表達(dá)存在差異，不同時(shí)間段抗病種質(zhì)的表達(dá)量都略高于感病種質(zhì)，這說明不同抗性水平的胡椒種質(zhì)PnNPR1基因的表達(dá)模式也存在一定的差異，這與橡膠樹HbNPR1基因的表達(dá)結(jié)果相近[24]?？共》N質(zhì)PnNPR1基因表達(dá)增強(qiáng)，有助于激活下游防衛(wèi)基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性。本研究中胡椒PnNPR1基因的獲得及其表達(dá)模式為開展PnNPR1功能與分子機(jī)制的研究及培育胡椒新品種奠定基礎(chǔ)。

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