‘紅肉蜜柚’果實汁胞?；c不同組分POD活性的關(guān)系

徐世榮　潘鶴立　吳嘉玲　宋敏娜　李小婷　張智偉　余磊　潘東明

摘 要 為了研究‘紅肉蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck. cv. Hongrou miyou]果實汁胞?；^程中不同結(jié)合態(tài)過氧化物酶（POD）的變化，以及赤霉素處理對此的影響。以赤霉素處理和未經(jīng)赤霉素處理的‘紅肉蜜柚果實的近中柱和遠(yuǎn)中柱汁胞為材料，統(tǒng)計粒化指數(shù)后，進(jìn)行POD提取體系篩選與酶活測定。發(fā)現(xiàn)‘紅肉蜜柚果實汁胞?；笖?shù)逐漸上升，有無赤霉素處理無明顯變化；可溶性POD最佳提取體系為pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl的緩沖液；離子結(jié)合POD的為含0.1% Triton和1 mol/L NaCl的pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液；未檢測到共價結(jié)合POD活性。此外，可溶性、離子結(jié)合POD活性在生長發(fā)育過程中整體呈下降趨勢，且無論是否經(jīng)赤霉素處理，近中柱與遠(yuǎn)中柱汁胞的可溶性POD活性均存在極顯著差異（p<0.01），而離子結(jié)合POD活性均無顯著差異（p>0.05）；無論近中柱或遠(yuǎn)中柱，有無赤霉素處理的可溶性POD均存在極顯著差異（p<0.01），而離子結(jié)合POD活性僅在遠(yuǎn)中柱汁胞中有極顯著差異（p<0.01）。所以，可溶性POD可能與汁胞?；P(guān)系密切，而離子結(jié)合、共價結(jié)合POD和赤霉素對汁胞粒化的影響有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞 ‘紅肉蜜柚；粒化；POD活性；赤霉素

中圖分類號 S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract To test the variation of different combined peroxidase（POD）during juice sac granulation in‘Hongroumiyou[Citrus grandis（L.）Osbeck. cv. Hongrou miyou]， and to investigate the influence of gibberellin（GA）on this process， the fruits of‘Hongroumiyousampled from normal and GA-treated plants were used as the models in this study， which were taken to calculate granulation index， and their juice sac near and away from the vascular cylinder were sampled to determine POD extraction and enzyme activity. The results showed that， the juice sac granulation index of‘Hongroumiyoushowed a rise. The treatment of GA did not significantly influence such variation pattern. pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl and pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl containing 0.1% Triton X-100 and 1 mol/L NaCl were established as the optimal extraction buffer for soluble and ion-bound POD， respectively. But， the covalently-bound POD was not extracted. The whole activities of soluble and ion-bound POD were both falling during growth and development process. The soluble POD activities between juice sacs close to the stele and away from the stele had significant difference（p<0.01）in normal and GA-treated fruits， and which between normal to GA-treated fruits also had significant difference（p<0.01）in juice sacs close to the stele and away from the stele， while the ion-bound POD activities had significant difference（p<0.01）in away from the stele. Therefore， soluble POD was significantly related to the process of juice sac granulation， However， the influence of ion-bound POD， covalently-bound POD and GA on juice sac granulation requires further investigation.

Key words ‘Hongroumiyoupummelo； Granulation； Activity of POD； Gibberellin

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.008

柚[Citrus maxima （Burm.） Merr.]是我國最重要的經(jīng)濟(jì)果樹之一，因其果實碩大，果肉香甜且富含對人體有益的維生素C、黃酮等成分而享譽(yù)世界[1]。但發(fā)生在果實發(fā)育和采后貯藏階段的汁胞粒化現(xiàn)象（見圖1）對其食用品質(zhì)和商品價值造成了嚴(yán)重影響[2]。因此，柚汁胞?；瘑栴}的研究對于柚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

目前關(guān)于柚生長發(fā)育過程中所發(fā)生的汁胞粒化現(xiàn)象，佘文琴[3]已從形態(tài)解剖學(xué)、生物學(xué)特性、生理生化和分子生物學(xué)角度進(jìn)行了研究，但還未能闡明?；漠a(chǎn)生機(jī)制。本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素代謝與柚汁胞?；芮邢嚓P(guān)，POD是木質(zhì)素形成過程中的一個關(guān)鍵酶，能催化木質(zhì)素前體發(fā)生氧化聚合反應(yīng)形成復(fù)雜的木質(zhì)素聚合物[4]。而且柚汁胞中木質(zhì)素積累與活性氧（H2O2）含量的顯著增加有關(guān)[5]，POD又是活性氧代謝中重要的活性氧清除酶之一。由此可見，POD與汁胞?；陌l(fā)生關(guān)系密切，且植物體內(nèi)的POD主要以可溶態(tài)、離子結(jié)合態(tài)、共價結(jié)合態(tài)3種形式存在[6]，因此本研究從木質(zhì)素代謝途徑入手，以?；^為嚴(yán)重的‘紅肉蜜柚汁胞為實驗材料，對參與木質(zhì)素前體氧化的3種不同形態(tài)POD建立最優(yōu)提取體系并對果實發(fā)育過程中POD酶活進(jìn)行相關(guān)分析，以期找出其與粒化的相關(guān)性。此外，還有研究表明，在柚果實膨大時期進(jìn)行赤霉素噴灑會加速果實?；M(jìn)程[7]。為此，本研究對部分試驗果樹噴布赤霉素作為對比，統(tǒng)計其?；笖?shù)的變化并觀察其對不同形態(tài)POD活性的影響，以期為后續(xù)汁胞?；瘷C(jī)制的研究提供更多有用的信息，從而解決生產(chǎn)上柚果實汁胞?；膯栴}。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘紅肉蜜柚果實來源于福建漳州平和縣，果實采摘于盛花期后95～211 d，這其間，對部分‘紅肉蜜柚樹于127 d進(jìn)行50 mg/L赤霉素處理。每個時期的樣品具備3個生物重復(fù)，每個生物重復(fù)由3個不同生長部位的果實混果而成。參照佘文琴[3]的方法進(jìn)行?；笖?shù)觀測記錄（見圖2）后，將各果實靠近中柱（近中柱）和靠近海綿層（遠(yuǎn)中柱）的汁胞分別取下，用液氮處理后存放在超低溫冰箱中（-80 ℃）備用。

1.1.2 試劑與設(shè)備 Tris（分析純）、Triton X-100（優(yōu)級純）、30% H2O2（優(yōu)級純）、NaCl（優(yōu)級純）、NaH2PO4（優(yōu)級純）、Na2HPO4（優(yōu)級純）、赤霉素（Gibberellic acid mix，生工，優(yōu)級純）、濃鹽酸（分析純）、愈創(chuàng)木酚（優(yōu)級純）、雙蒸水（ddH2O）、石英砂等。

渦旋儀（MX-S）、恒溫?fù)u床（ZWY-240）、恒溫循環(huán)水浴裝置（HH-501）、紫外可見分光光度計（TU-1901）、臺式高速冷凍離心機(jī)（Allegra X-22）、小型研缽、10 mL離心管、移液槍等。

1.2 方法

1.2.1 可溶性POD提取體系篩選 取1 g左右的汁胞樣品，按表1 A～L 12種緩沖液組合（緩沖液事先于冰上預(yù)冷）于冰上小型研缽中加入少量石英砂進(jìn)行研磨，固液比為1 ∶ 4（先用2 mL進(jìn)行研磨，再用1 mL洗滌2次）。研磨結(jié)束后將樣品徹底轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，徹底渦旋，4 ℃、15 000 ×g離心10 min，取上清進(jìn)行酶活測定并記錄上清總體積。每個組合重復(fù)4次，全程在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.2.2 離子結(jié)合POD提取體系篩選 用上述篩選出的最優(yōu)可溶性POD提取緩沖液（pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液）按上述方法提取可溶性POD，并將沉淀物中的可溶性POD洗至沒有活性后，加入分別含0.1% Triton X-100、1 mol/L NaCl、 （0.1%

Triton X-100+1 mol/L NaCl）、 （0.1% Triton X-100+

10% glycerin）、（1 mol/L NaCl+10% glycerin）、（0.1%

Triton X-100+1 mol/L NaCl+10% glycerin）、 （0.1%

Tweens+1 mol/L NaCl）、（0.1% CTAB+1 mol/L NaCl）的pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液。參照王蓓[8]的方法，進(jìn)行徹底渦旋，于16 ℃恒溫?fù)u床中280 r/min振蕩1 h，4 ℃、15 000 ×g離心10 min，取上清進(jìn)行酶活測定并記錄上清總體積。每個組合重復(fù)4次，全程在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.2.3 共價結(jié)合POD活性測定 用上述優(yōu)化的最佳緩沖液提取離子結(jié)合POD后，將沉淀物中的離子結(jié)合POD洗至沒有活性，再用pH5.5，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌3次。參考García-Gómez等[9]的方法，加入含0.5%（p/v）纖維素酶、2.5%（p/v）果膠酶的pH5.5，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液4 mL，于20 ℃恒溫?fù)u床中300 r/min振蕩5 h，4 ℃、15 000 ×g離心10 min，取上清進(jìn)行酶活測定并記錄上清總體積。每份樣品重復(fù)4次。

1.2.4 汁胞各發(fā)育時期POD酶活測定 參考Venkatachalam等[10]的方法，用上述優(yōu)化后的最佳緩沖液提取汁胞各發(fā)育時期不同部位的POD后，按表2的體系組分配比于25 ℃、470 nm測定并記錄1 min內(nèi)的吸光值變化。單位鮮重的樣品每分鐘變化0.01個吸光值定義為一個酶活力單位，即：

1 U=ΔA470/（g FW·min）

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件及Excel 2010進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性POD提取體系篩選

提取緩沖液的組分、濃度及pH值對所提取的可溶性POD酶活力有一定的影響，為獲得具有較高酶活力的‘紅肉蜜柚可溶性POD，以便于后期研究，本試驗對可溶性POD提取體系進(jìn)行初步篩選。由圖3可以看出，在所測試的3個因素的組合中，pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl提取體系獲得的可溶性POD活性最高，因此，將該提取體系用于‘紅肉蜜柚汁胞可溶性POD的提取。

2.2 離子結(jié)合POD提取體系篩選

關(guān)于柚汁胞中的離子結(jié)合POD尚未有研究報道，為獲得具有較高酶活力的離子結(jié)合POD，以便對其進(jìn)行后續(xù)研究，本試驗對離子結(jié)合POD提取體系進(jìn)行初步的篩選。由圖4可知，緩沖液中不同添加劑對離子結(jié)合POD的提取效果差異很大。0.1% Triton和1 mol/L NaCl單獨添加或在單獨添加的基礎(chǔ)上均添加10%甘油提取效果都較差，而0.1% Triton和1 mol/L NaCl一起使用則提取效果顯著提高，但其添加10%甘油后則效果不佳，此外，將去垢劑Triton換成Tweens或CTAB后，提取效果均不如Triton。因此，本試驗選用添加0.1% Triton和1 mol/L NaCl的pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl作為柚汁胞離子結(jié)合POD的提取體系。

2.3 共價結(jié)合POD活性測定

關(guān)于柚汁胞中共價結(jié)合POD的研究也未見報道。在預(yù)試驗中分別取盛花期后107、137、170和191 d的樣品進(jìn)行共價結(jié)合POD活性測定，結(jié)果均未能檢測，可能柚汁胞中確實不存在共價結(jié)合POD，或因0.1% Triton+1 mol/L NaCl提取過程較劇烈，導(dǎo)致共價結(jié)合POD失活。

2.4 汁胞各生長發(fā)育時期POD活性測定

由圖5可知，未經(jīng)赤霉素處理與經(jīng)赤霉素處理的可溶性POD活性在生長發(fā)育過程中整體均呈下降趨勢，且經(jīng)赤霉素處理后的近中柱、遠(yuǎn)中柱汁胞可溶性POD活性均比未經(jīng)赤霉素處理的低。通過配對樣本T檢驗發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)赤霉素處理的近中柱與遠(yuǎn)中柱汁胞的可溶性POD活性存在極顯著差異（p<0.01），經(jīng)赤霉素處理后的近中柱與遠(yuǎn)中柱汁胞的可溶性POD活性也存在極顯著差異（p<0.01）；且有無赤霉素處理的近中柱汁胞可溶性POD活性存在極顯著差異（p<0.01），有無赤霉素處理的遠(yuǎn)中柱汁胞可溶性POD活性也存在極顯著差異（p<0.01）。

如圖6所示，未經(jīng)赤霉素處理與經(jīng)赤霉素處理的離子結(jié)合POD活性在生長發(fā)育過程中整體亦呈下降趨勢，同可溶性POD相比，活性較低，與其存在極顯著差異（p<0.01）。配對樣本T檢驗顯示，未經(jīng)赤霉素處理的近中柱與遠(yuǎn)中柱汁胞的離子結(jié)合POD活性無顯著差異（p>0.05），經(jīng)赤霉素處理后的近中柱與遠(yuǎn)中柱汁胞的離子結(jié)合POD活性也無顯著差異（p>0.05）；且有無赤霉素處理的近中柱汁胞離子結(jié)合POD活性同樣無顯著性差異（p>0.05），但是，有無赤霉素處理的遠(yuǎn)中柱汁胞離子結(jié)合POD活性卻有極顯著性差異（p<0.01）。

3 討論

從研究結(jié)果可以看出，根據(jù)結(jié)合形態(tài)，‘紅肉蜜柚果實汁胞中POD主要以可溶性和離子結(jié)合狀態(tài)存在，在生長發(fā)育過程中，伴隨?；笖?shù)的升高，汁胞中的可溶性POD活性整體呈下降趨勢，與佘文琴[3]的研究相一致。近中柱與遠(yuǎn)中柱可溶性POD活性的極顯著差異表明POD可能與汁胞?；芮邢嚓P(guān)，而赤霉素的處理使可溶性POD活性與未處理的也出現(xiàn)了極顯著的差異，說明赤霉素可能對汁胞粒化有一定的影響。但是，赤霉素處理后近中柱與遠(yuǎn)中柱汁胞的可溶性POD活性均降低，且從汁胞?；笖?shù)的最終結(jié)果來看，赤霉素處理與未經(jīng)處理的相比，其?；笖?shù)較低但是并無顯著性差異，其粒化的進(jìn)程也并未提前或者變快。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果[11]并不一致，可能是由于對試驗果樹果實赤霉素噴布的次數(shù)過少和噴布時的天氣過于炎熱，導(dǎo)致果面水分迅速蒸發(fā)使得溶解其中的赤霉素未能充分地運輸?shù)焦麑崈?nèi)部有關(guān)。因此，赤霉素處理對?；木唧w作用有待進(jìn)一步研究。

此外，木質(zhì)素代謝的相關(guān)研究還表明，木質(zhì)素的氧化反應(yīng)及聚合過程均發(fā)生于細(xì)胞壁上[4，12]，所以細(xì)胞壁上的離子結(jié)合態(tài)POD可能和?；年P(guān)系更為密切，但目前關(guān)于?；^程中的離子結(jié)合態(tài)POD卻未見研究報道。可是，從本試驗離子結(jié)合POD的酶活結(jié)果可知，其變化上并未顯示出與?；南嚓P(guān)性，且其酶活性較可溶性POD低很多，近、遠(yuǎn)中柱也未表現(xiàn)出顯著性差異，只是遠(yuǎn)中柱赤霉素處理與未處理的酶活有極顯著差異，這可能與遠(yuǎn)中柱較靠近果實外圍受赤霉素影響較大有關(guān)。但是，?；瘯r期，POD同工酶譜實驗中，卻發(fā)現(xiàn)離子結(jié)合POD出現(xiàn)了5個特異性堿性POD組分，可能與汁胞?；P(guān)系密切（待發(fā)表）。所以，POD在?；^程中所扮演的具體角色仍有待進(jìn)一步研究。

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