2種提取工藝對橄欖果實(shí)多酚含量及抗氧化活性的影響

常強(qiáng) 蘇明華 陳清西 曾碧玉 王偉 李惠華

摘 要 以橄欖果實(shí)為原料，利用正交實(shí)驗(yàn)探討有機(jī)溶劑和超聲波提取對多酚提取量和總還原力FRAP的影響，并分析比較2種提取方法，以確定最佳提取條件和參數(shù)。結(jié)果表明：有機(jī)溶劑提取的最佳工藝參數(shù)料液比為1 ∶ 60、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃、乙醇濃度50%，其多酚提取量和總還原力FRAP分別為79.07 mg/g和740.45 μmol/g。超聲波提取的最佳工藝參數(shù)料液比1 ∶ 40、提取時(shí)間20 min、超聲功率180 W及乙醇濃度60%，該條件下多酚提取量和總還原力FRAP分別為85.26 mg/g和952.27 μmol/g。超聲波提取具有多酚提取量高、抗氧化活性強(qiáng)、提取時(shí)間短、溶劑耗量少的特點(diǎn)，優(yōu)于有機(jī)溶劑提取。

關(guān)鍵詞 橄欖；多酚；抗氧化；提取工藝

中圖分類號 TQ91 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract To optimize the extraction technology of polyphenols as antioxidants in Cauarium album fruit. The extraction methods using organic solvent and ultrasound-assisted extraction were studied in this paper. The Orthogonal design was used to investigate the effects of extraction methods on the total polyphenols（TP）and antioxidant activity[Ferric ion Reducing Antioxidant Power（FRAP）]. The results indicated that the optimal extraction conditions for organic solvent extraction wereliquid/solid ratio 1 ∶ 60（g/mL）， time 60 min， temperature 60℃ and ethanol concentration， 50%. Under the optimum conditions， the extraction yield of TP and the total reducing antioxidant power（FRAP）was 79.07 mg/g and 740.45 μmol/g， respectively， while the extraction yield of TP was 85.26 mg/g and antioxidant activity was 952.27 μmol/g by optimal extraction conditions for ultrasonic-assisted extraction using liquid to solid ratio of 1 ∶ 40（g/mL）for 20 min at the ultrasonic power of 180 W and ethanol concentration of 60%（V/V）. Ultrasound-assisted extraction could be used as an alternative to organic solvent extraction with respect to higher extraction of polyphenols and maximized antioxidant activity with the advantages of shorter extraction time and low solvent consumption.

Key words Cauarium album； Polyphenols； Antioxidant activity； Extraction process

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.021

近年的研究表明，膳食多酚因具有抗氧化和清除自由基的特點(diǎn)，可抑制腫瘤以及心血管、神經(jīng)性退化等慢性疾病[1-2]。因此，富含多酚類物質(zhì)的植物資源受到廣泛關(guān)注。橄欖[Cauarium album（Lour.）Raeusch]屬無患子目橄欖科（Burseraceae）橄欖屬（Cauarium）植物，原產(chǎn)中國，其中福建為主產(chǎn)地。橄欖富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，自古常用于中藥材，可治咽喉腫痛、咳嗽吐血、菌痢、癲癇、腸炎腹瀉、手腳酸麻、魚蟹中毒、醉酒等病癥[3]。多酚為橄欖果實(shí)主要活性物質(zhì)，已有報(bào)道的化合物主要有沒食子酸、鞣花酸等活性物質(zhì)[4-13]。研究表明橄欖多酚具抗氧化活性[14]、抗菌消炎[15]、解酒護(hù)肝[16]、調(diào)節(jié)血脂、降血糖[17-18]等生理活性。

目前，關(guān)于橄欖多酚提取優(yōu)化工藝的研究已有報(bào)道[7，19-21]，主要以多酚提取率為評價(jià)指標(biāo)，而并未考慮提取方法對抗氧化活性的保持作用，但生產(chǎn)應(yīng)用多酚主要是因其具有強(qiáng)的抗氧化特性。因此，在優(yōu)化提取多酚的同時(shí)應(yīng)考慮提取條件對抗氧化活性保存的影響。FRAP（Ferric reducing antioxidant power，鐵離子還原抗氧化劑能力）是用于評價(jià)抗氧化劑的總還原能力的常用方法，是反應(yīng)物質(zhì)在氧化還原反應(yīng)中給出電子自身發(fā)生氧化的能力，以此反映抗氧化劑的抗氧化能力[22]。據(jù)此，本研究以橄欖果實(shí)多酚提取量和總還原力FRAP為評價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化溶劑浸提和超聲波提取工藝，并比較2種提取方法的優(yōu)劣，確定最佳提取工藝，為橄欖果實(shí)多酚的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

橄欖：‘長營品種，于2015年11月20日采自福建省閩清縣梅溪鎮(zhèn)白石坑村久源橄欖專業(yè)合作社（26°14′55″N，118°51′57″E），選擇成熟一致、無機(jī)械損傷、無病蟲害、大小均一的完全成熟果實(shí)，所采樣品裝入4 ℃采樣箱，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，用自來水沖洗干凈，過蒸餾水，晾干后用小刀手工取核，然后用液氮快速冷凍，在真空冷凍干燥機(jī)下凍干，粉碎，過40目篩，-40 ℃保存待用。

試劑：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（GA）（HPLC純≥98%），F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑（分析純），trolox[（±）-6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]，TPTZ（1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine），Sigma-Aldrich 公司；無水碳酸鈉，乙醇均為分析純。

儀器：Lambda 35紫外/可見光光譜儀，PerkinElmer Corporation；真空冷凍干燥機(jī)，Thermo HetoPowerDry LL1500凍干機(jī)（Thermo Electron Corporation）；SHA-BA水浴恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司；TGL-16G 臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 有機(jī)溶劑提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別稱取1 g凍干橄欖果實(shí)粉末，置于100 mL三角瓶內(nèi)，加入40 mL 60%乙醇水溶液，用瓶塞蓋上三角瓶口，用水浴震蕩器浸提，提取1次，4 000 r/min離心5 min，定容，進(jìn)行測定。固定其它條件，分別考察乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時(shí)間對橄欖果實(shí)多酚含量的影響。確定較佳的單因素實(shí)驗(yàn)條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以料液比、溫度、時(shí)間、乙醇濃度為主要影響因素，每個因素設(shè)3個水平，安排四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。

1.2.2 超聲波提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別稱取1 g凍干橄欖果實(shí)粉末，置于100 mL離心管內(nèi)，加入20 mL 60%乙醇水溶液，用一次性薄膜封口，用超聲波細(xì)胞破碎儀浸提，提取1 次，4 000 r/min離心5 min，定容，進(jìn)行測定。分別考察液料比、提取時(shí)間、提取功率、乙醇濃度對橄欖果實(shí)多酚含量的影響，確定最佳單因素實(shí)驗(yàn)條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以液料比、提取時(shí)間、提取功率、乙醇濃度為主要影響因素，各選出3 個水平，安排四因素三水平L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見表2。

1.2.3 多酚含量（TP）測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[4]并作適當(dāng)修改。所有提取液加雙蒸水稀釋，使得其可讀取范圍在標(biāo)準(zhǔn)曲線0.0～120 μg GA/mL范圍內(nèi)。在15 mL塑料離心管中，加入1 mL沒食子酸溶液，然后加入1 mL Folin-Ciocalteu試劑，充分混勻，室溫下靜置3 min，加1.5 mL 10% Na2CO3溶液。加雙蒸水使終體積為10 mL，充分混勻反應(yīng)液，30 ℃下避光放置120 min后，于波長765 nm吸光度下用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定。沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，總多酚提取量以每g干質(zhì)量等同于沒食子酸的毫克數(shù)表示（mg/g）。重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 抗氧化能力 采用鐵離子還原能力（Ferric reducing ability of power，F(xiàn)RAP）法測定[23]。簡言之，準(zhǔn)確吸取樣品溶液50 μL，加入3 mL TPTZ工作液，37 ℃下有機(jī)溶劑30 min，測定593 nm處的吸光度。Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中FRAP值以每g干重相當(dāng)Trolox的微摩爾數(shù)表示（μmol/g）。重復(fù)3次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)平行3次，數(shù)據(jù)均以平均值表示，方差分析均采用SPSS18.0 for windows軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

有機(jī)溶劑提取按表1因素與水平試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，結(jié)果分析見表4、5、6和圖1。由表4 極差分析結(jié)果可知，各因素對多酚提取量和總還原力FRAP的影響程度依次為：D>B>C>A，即乙醇濃度>提取時(shí)間>提取溫度>料液比。這說明乙醇濃度對橄欖多酚提取量和FRAP的影響最大。結(jié)合多酚和FRAP 2個指標(biāo)值，確定優(yōu)化組合為A2B3C3D1，即在料液比1 ∶ 60、提取時(shí)間90 min、提取溫度60 ℃及50%乙醇濃度下，多酚提取量和總還原力FRAP最高。

正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表5、6及圖1。除因素A對多酚提取量的不顯著外，B、C及D的顯著性水平均小于0.05；可見，除料液比外，提取溫度、提取時(shí)間及乙醇濃度均對橄欖多酚提取量和FRAP有顯著影響。結(jié)合R值可見，乙醇濃度是有機(jī)溶劑提取的關(guān)鍵因素。如圖1所示，綜合各因素對多酚提取量和FRAP的影響，以A2B3C3D1為最優(yōu)試驗(yàn)組合，與極差分析結(jié)果相同。而從表3中9組試驗(yàn)組合可見，提高多酚提取量和保持生物活性的最佳工藝組合為A2B2C3D1，2種組合間只有時(shí)間不同，考慮到本實(shí)驗(yàn)主要是研究提取工藝對橄欖生物活性的保持能力，因此選擇時(shí)間較短的組合A2B2C3D1。

由于有機(jī)溶劑提取工藝最佳理論組合不在于9個處理中，需追加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。精確稱取橄欖干粉1 g，在料液比1 ∶ 60、提取時(shí)間90 min、有機(jī)溶劑溫度60 ℃、50%乙醇的最佳提取條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，橄欖多酚提取量和FRAP分別為（79.83± 0.23）mg/g和（720.34±16.85）μmol/g（n=3），多酚提取量略高于正交試驗(yàn)結(jié)果（79.07 mg/g），而FRAP略低于正交試驗(yàn)結(jié)果（740.45 μmol/g），這可能是由于提取時(shí)間過長，持續(xù)溫度過高導(dǎo)致橄欖多酚總還原能力降低。因此綜合對多酚提取量和總還原力的影響，可采用正交試驗(yàn)表中組合A2B2C3D1，即料液比1 ∶ 60、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃以及50%乙醇為最佳提取工藝條件。

2.2 超聲波提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

超聲波提取按表2因素與水平試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，結(jié)果分析見表8、9、10和圖2。由表9極差分析結(jié)果可知，各因素對多酚提取量和總還原力FRAP的影響程度分別為A>B>D>C和A>C>B>D。這說明A料液比對橄欖多酚提取量和FRAP的影響最大。結(jié)合多酚和FRAP 2個指標(biāo)值，確定優(yōu)化組合為A3B1C3D2，即在料液比1 ∶ 40、提取時(shí)間20 min、超聲功率180 W及60%乙醇濃度下，多酚提取量和總還原力FRAP均為最高。

正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表10、11及圖2。四個因素對多酚提取量和總還原力FRAP均表現(xiàn)為顯著水平。可見，料液比、提取時(shí)間、超聲功率及乙醇濃度均對橄欖多酚提取量和FRAP有顯著影響。結(jié)合R值可見，料液比是超聲波提取的關(guān)鍵因素。如圖2所示，結(jié)合各因素對多酚提取量和FRAP的影響，以A3B1C3D2為最優(yōu)試驗(yàn)組合，該組合與極差分析結(jié)果相同。

對多酚提取量和總還原力FRAP的綜合分析得出，超聲波提取工藝最佳理論組合為A3B1C3D2。即料液比1 ∶ 40、提取時(shí)間20 min、超聲功率180 W及60%乙醇。該組合出現(xiàn)在9組試驗(yàn)的第7組合中，因此確定最終組合為A3B1C3D2為最佳提取工藝條件。

2.3 有機(jī)溶劑提取與超聲波提取的比較

分別采用有機(jī)溶劑提取和超聲波提取橄欖果實(shí)中多酚以對總還原力FRAP的影響，結(jié)果顯示，超聲波提取法最佳工藝提取多酚含量為85.26 mg/g，F(xiàn)RAP為952.27 μmol/g，有機(jī)溶劑提取法多酚含量為79.07 mg/g，F(xiàn)RAP為740.45 μmol/g。相比有機(jī)溶劑提取，超聲波提取法的多酚提取量和總還原力FRAP分別提高了6.19 mg/g和211.82 μmol/g，可見超聲波提取優(yōu)于有機(jī)溶劑提取工藝。

3 討論與結(jié)論

常見的植物多酚提取有溶劑浸提、超聲波提取、微波提取等方法[24]。有機(jī)溶劑浸提是根據(jù)植物多酚與提取溶劑的溶解性差異進(jìn)行提取[25]。對山核桃仁[26]、香蕉皮[27]、茶樹菇[28]總多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出不同的提取工藝條件，這可能是由于不同材料中多酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)受到不同溶劑極性、溫度、溶劑量等因素的影響水平所致[29]。本研究對有機(jī)溶劑提取工藝優(yōu)化表明，在料液比1 ∶ 60、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃、50%乙醇濃度條件下，橄欖多酚提取量和總還原力FRAP為79.07 mg/g和740.45 μmol/g。而林玉芳等[20]研究表明在最優(yōu)提取工藝條件下，橄欖多酚的提取得率為32.13%，提取率高于本研究結(jié)果，這是因?yàn)閮烧邔Χ喾雍坎捎貌煌臏y試方法造成多酚提取量的不同。

超聲波提取是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，形成共振腔，使細(xì)胞膨脹以及細(xì)胞壁破碎，有效成分高效溶出[30]。利用該方法優(yōu)化提取植物多酚已有大量報(bào)道。馮子旺[31]等優(yōu)化得到桑黃多酚提取工藝為乙醇濃度60%，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50 ℃，料液比1 ∶ 25，該條件下其總多酚提取率可達(dá)26.4 mg/g。鄭利琴等[32]對楊梅汁多酚的提取工藝進(jìn)行研究表明乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲波功率500 W，處理時(shí)間35 min，料液比為1 ∶ 4，多酚提取量為609.256 mg/L。橄欖超聲波提取法的優(yōu)化工藝為料液比1 ∶ 40、提取時(shí)間20 min、超聲功率180 W、乙醇濃度60%，該條件下多酚提取量為85.26 mg/g，總還原力FRAP為952.27 μmol/g。這與上述研究結(jié)果略有不同，可能是不同植物材料中總多酚極性及其組成成分需要不同的提取條件。

對2種提取方法比較顯示，超聲波提取具有提取時(shí)間短（20 min）、溶劑用量少（1 ∶ 40）、多酚提取量大（85.26 mg/g）、總還原力強(qiáng)（952.27 μmol/g）的優(yōu)點(diǎn)。表明超聲波提取橄欖果實(shí)多酚具有提取速度快，溶劑用量少，能有效避免因時(shí)間持續(xù)長，溫度積累過高導(dǎo)致有效成分損失以及抗氧化能力降低，處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，所以從節(jié)約成本，實(shí)際生產(chǎn)角度考慮，超聲波提取是一種較好的工藝方法。

通過正交優(yōu)化，本研究確定了橄欖果實(shí)多酚提取的最優(yōu)有機(jī)溶劑條件為料液比1 ∶ 60、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃、50%乙醇濃度。在此條件下，橄欖多酚提取量和總還原力FRAP為79.07 mg/g和740.45 μmol/g。超聲波提取法的最優(yōu)條件為料液比1 ∶ 40、提取時(shí)間20 min、超聲功率180 W及60%乙醇。在此條件下，橄欖多酚提取量為85.26 mg/g，總還原力FRAP為952.27 μmol/g。超聲波提取對多酚提取量和抗氧化能力明顯優(yōu)于有機(jī)溶劑提取，因此超聲波提取是一種較為理想的提取橄欖果實(shí)多酚的方法。

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