柯毅湧 潘騰飛 葉如夢 張蒙 郭志雄 佘文琴 周玉 潘東明

摘 要 以‘中國水仙（Narcissus tazetta L. var. Chinensis Roem）盛花期花瓣為試驗材料，采用高效液相色譜與多級質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MSn）技術(shù)進行鑒定，比較采用2種提取方法（非酸水解法與酸水解法）提取類黃酮物質(zhì)的優(yōu)缺點。結(jié)果表明：用非酸水解法和酸水解法在盛花期花瓣中共鑒定到了4種黃酮醇類物質(zhì)，1種酚酸類物質(zhì)，其中，用非酸水解法首次在中國水仙花瓣中鑒定到了水仙苷，說明該法能在提取過程中避免水仙花瓣類黃酮物質(zhì)糖苷鍵的斷裂，獲得更豐富的類黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，為中國水仙類黃酮物質(zhì)成分的分析提供參考。

關(guān)鍵詞 中國水仙；盛花期；酸水解法；非酸水解法；HPLC-MSn

中圖分類號 S682.21 文獻標識碼 A

Abstract In this study，the petals of‘Narcissus tazetta L. var. chinensis Roemduring full-bloom stage were taken as the experimental materials. The comparison between non-acid hydrolyzation and acid hydrolyzation methods on flavonoids extraction was carried out. High Performance Liquid Chromatography（HPLC） and High Performance Liquid Chromatography-mass spectrometry（HPLC-MSn）techonlogy were employed to compare the advantages and disadvantages of the two extraction methods. The experiment results showed that four flavonols and one phenolic acid were identified in the petals during full-bloom stage by means of non-acid hydrolyzation and acid hydrolyzation. It was the first time that the narcissoside was identified in the petals of Narcissus by means of non-acid hydrolyzation，which indicating that this method could avoid the fracture of glycosidic bond of flavonoids in narcissus petals and obtain more abundant structural information. The results would provide references for analyzing the components of flavonoids in ‘Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem.

Key words Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem；Full-bloom stage；Acid hydrolyzation；Non-acid hydrolyzation；HPLC-MSn

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.027

花是觀賞植物最主要的觀賞部分，花色是觀賞花卉最直觀的觀賞性狀之一[1]，花色五彩繽紛，其主要由三大類花色素決定：即類黃酮、類胡蘿卜素及與生物堿有關(guān)的其它色素，如甜菜堿、小檗堿等[2]。

中國水仙是石蒜科水仙屬多花水仙（Narcissus tazetta）亞屬的多年生草本植物，其花潔白清香，花婷玉立，絢麗多姿，素有“凌波仙子”的美稱，是中國的十大傳統(tǒng)名花之一[3]。中國水仙花色形成主要受類胡蘿卜途徑和類黃酮途徑調(diào)控，其中類胡蘿卜途徑是中國水仙黃色副冠花色合成的主要途徑[4]。張慧平[5]研究表明，中國水仙黃色副冠的花色素成分主要是類胡蘿卜途徑中的葉黃素和β-胡蘿卜素，白色花瓣中2種色素含量都很少。在已有的報道中，關(guān)于中國水仙花瓣類黃酮途徑的色素成分尚不明確。何炎森[6]使用非酸水解法提取中國水仙盛花期花瓣的類黃酮成分并用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)進行檢測，得出其主要成分為柚皮苷、蘆丁和綠原酸。羅鵬[7]利用鹽酸、氨水的特征顯色和染色法結(jié)合鑒定了中國水仙盛花期白色花瓣的類黃酮成分，得出其主要的黃酮類物質(zhì)為黃酮和黃酮醇，不含花色素苷或花色素苷的含量極低。

HPLC鑒定方法是將二極管陣列（DAD）檢測器獲得的吸收光譜與標準品進行對照，從而鑒定出類黃酮的化學結(jié)構(gòu)，此法對于已知成分的定性具有一定的優(yōu)勢[8-10]，但其不能對未知成分的物質(zhì)進行定性。使用鹽酸、氨水的特征顯色和染色法雖然簡單高效，不過只能對類黃酮物質(zhì)的類別進行分析，未能做到準確的定性。高效液相色譜與多級質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MSn）技術(shù)具有樣品消耗量小、靈敏度高、選擇性強、分離和結(jié)構(gòu)確證一次完成等優(yōu)點[11]，在未知物的定性方面，目前已在甘薯[12]、枇杷[10]、金蓮花[13]、火龍果[14]等植物上有所報道，但使用這種技術(shù)識別中國水仙盛花期花瓣的黃酮類成分尚未見報道。本研究擬用HPLC-MSn法鑒定不同提取方法所得的中國水仙白色花瓣的類黃酮成分，為其色素成分的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗材料為中國水仙三年生種球，購于福建漳州龍海市九湖鎮(zhèn)田中央村。于2015年1月取盛花期花瓣用于中國水仙類黃酮成分提取。所有材料均在采后用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 非酸水解法提取類黃酮 參照陳源[15]的方法提取類黃酮。

1.2.2 酸水解法提取類黃酮 參照Muir等[16]的方法提取類黃酮。

1.2.3 HPLC-MSn檢測類黃酮 HPLC（Agilen1260）檢測條件為：C18色譜柱（Agilent Eclipse Plus， 2.1×100 mm，i.d），柱溫為30 ℃，流動相A為1%乙酸水溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序為：0～2 min，5%B；2～20 min，5%～30%B；20～23 min，30%～95%B。

質(zhì)譜（6410，Agilent）條件為：電噴霧電離源（ESI），毛細管電壓3.5 kV，離子源溫度350 ℃，干燥器（N2）流速11 L/min，霧化壓力（350 psi，Delta EMV）300 V ，mass 采集 200～1 000 Da，負離子模式。

質(zhì)譜分析參考文獻[17-19]進行，花色苷類物質(zhì)在540 nm 下分析，類黃酮類物質(zhì)在280 nm 下分析。為確定各類物質(zhì)在紫外-可見光下的吸收特征，對所檢測到的峰在波長 200～540 nm 的物質(zhì)進行掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 非酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮成分的鑒定

非酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮物質(zhì)的HPLC總離子流色譜圖見圖1。在負離子模式下，3種酚酸和類黃酮物質(zhì)在28 min內(nèi)均得到很好的分離，按保留時間出峰順序先后分別為1號峰、2號峰和3號峰，從峰面積可推測3種物質(zhì)的含量大小順序為3號峰>2號峰>1號峰。從圖1可以看出，3種物質(zhì)的峰型和分離度較好，可滿足不同極性的類黃酮物質(zhì)的分離要求。經(jīng)DAD檢測可知，3種物質(zhì)在280 nm和320 nm處均有紫外吸收峰（表1），1號峰物質(zhì)的出峰時間為6.99 min，一級質(zhì)荷比為353，二級質(zhì)荷比為191、85；2號峰物質(zhì)的出峰時間為13.118 min，一級質(zhì)荷比為609，二級質(zhì)荷比為300、271；3號峰物質(zhì)的出峰時間為14.933 min，一級質(zhì)荷比為623，二級質(zhì)荷比為315。根據(jù)物質(zhì)一級質(zhì)譜母荷離子數(shù)據(jù)以及二級質(zhì)譜碎片離子信息，推測1號峰物質(zhì)為酚酸類的綠原酸，2號、3號峰物質(zhì)分別為黃酮醇類的蘆丁和水仙苷。

2.2 酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮成分的鑒定

酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮物質(zhì)的HPLC總離子流色譜圖見圖2。在與非酸水解法相同的HPLC-MSn檢測條件下，28 min內(nèi)分離得到了3種酚酸類和類黃酮物質(zhì)，按保留時間出峰順序先后分別為1號峰、2號峰和3號峰，從峰面積可推測3種物質(zhì)的含量大小順序為3號峰>2號峰>1號峰。如圖2所示，3種物質(zhì)的峰型較非酸水解法提取的類黃酮物質(zhì)好，說明酸水解法提取的類黃酮物質(zhì)雜質(zhì)較少，對檢測的干擾小。經(jīng)DAD檢測可知，3種物質(zhì)在280 nm和320 nm處均有紫外吸收峰（表2），1號峰物質(zhì)的出峰時間為6.859 min，一級質(zhì)荷比為353，二級質(zhì)荷比為191、85；2號峰物質(zhì)的出峰時間為19.399 min，一級質(zhì)荷比為301，二級質(zhì)荷比為151；3號峰物質(zhì)的出峰時間為22.662 min，一級質(zhì)荷比為315，二級質(zhì)荷比為300。經(jīng)對比，推測1號峰物質(zhì)為酚酸類的綠原酸，2號、3號峰物質(zhì)分別為黃酮醇類的槲皮素和異鼠李素。

3 討論

3.1 不同提取方法所得中國水仙花瓣類黃酮成分的差異

本研究采用非酸水解法和酸水解法提取中國水仙花瓣類黃酮成分，其中的酸水解法被廣泛運用于黃酮苷元化合物的提取。羅美紅等[22]采用酸水解法提取了枇杷葉片的總黃酮成分，得到了黃酮苷元山萘酚和槲皮素。文瑞芝[23]采用萃取-酸水解法分離得到了大豆異黃酮苷元。鄧少東等[24]測定了橘紅中酸水解前后類黃酮成分的變化，酸水解前主要為柚皮苷、野漆樹苷，酸水解后柚皮苷和野漆樹苷分別形成苷元柚皮素和芹菜素。

非酸水解法提取得到黃酮苷已在番茄[16]、刺茉莉[25]、杜鵑[26]中有所報道。由于類黃酮化合物的特性，即可以在多個位置結(jié)合多種糖苷，僅幾十種黃酮苷元可形成種類繁多的黃酮苷化合物。將提取得到的黃酮苷化合物經(jīng)HPLC-MSn技術(shù)鑒定可獲得糖苷鍵連接的位置和糖苷的碎片離子等多種信息[19]，有助于研究推斷類黃酮化合物在花色形成過程中的作用。

本研究通過酸水解法提取鑒定得到的槲皮素和異鼠李素分別是非酸水解法提取得到的蘆丁和水仙苷的苷元，說明酸水解能夠使蘆丁和水仙苷的糖苷鍵充分斷裂。通過2種方法的比較，確認了中國水仙花瓣中類黃酮物質(zhì)在自然狀態(tài)下主要是以蘆丁和水仙苷2種形態(tài)存在，這與何炎森等[27]通過非酸水解法并利用液相色譜技術(shù)（HPLC）在中國水仙盛花期提取鑒定到的2種主要的類黃酮成分（蘆丁、柚皮苷）有所不同，這可能與2種鑒定技術(shù)的差異有關(guān)，何炎森等[27]采用的HPLC法鑒定類黃酮物質(zhì)周期長，所測成分單一，需有對照品才能對未知物質(zhì)進行定性；而本研究采用的高效液相色譜與多級質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MSn）技術(shù)是將高效液相色譜的分離與質(zhì)譜的選擇性和靈敏性結(jié)合起來，尤其是在缺少對照品的情況下能對化合物進行準確的定性分析。

3.2 HPLC-MSn結(jié)合ESI和DAD技術(shù)在定性苷類物質(zhì)中有獨特的優(yōu)勢

觀賞植物花瓣類黃酮物質(zhì)大部分以苷類的形式存在，由于苷類物質(zhì)有很大的極性，高溫強酸等劇烈條件下易分解，揮發(fā)性不強。質(zhì)譜作為一種常用的分析手段，在植物類黃酮研究中發(fā)揮了重要作用，傳統(tǒng)的電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）、化學電離質(zhì)譜（CI-MS）等難以準確地對未衍化的苷類化合物進行定性分析[28]，存在較多的局限性。隨著各種軟電離源（即質(zhì)譜分析中采用各種離子源把分子解離成離子或碎片）如電離子噴霧（ESI）、大氣壓霧化電離源（APCI）、快源子轟擊源質(zhì)譜（FAB）等的出現(xiàn)，直接測定黃酮苷類物質(zhì)成為可能，同時結(jié)合多級質(zhì)譜聯(lián)用、二級管陣列檢測器（DAD）的碰撞誘導、捕捉紫外吸收峰等功能，可以獲得豐富的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。ESI-MS技術(shù)適用于極性大、難揮發(fā)的物質(zhì)，其靈敏度、重現(xiàn)性均優(yōu)于其它電離源，在糖苷化合物的分析上有明顯的優(yōu)勢。本研究采用HPLC-MSn結(jié)合ESI和DAD技術(shù)，分析了經(jīng)非酸水解法提取得到的中國水仙盛花期花瓣中的類黃酮苷類化合物，得到了其經(jīng)ESI源轟擊產(chǎn)生的負離子一級質(zhì)譜母荷信息、二級質(zhì)譜下的碎片離子信息和其DAD紫外吸收峰范圍。其中2號峰信息與Milbury等[17]、吳子江[29]、李自紅等[30]獲得的蘆丁一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜下的碎片離子信息和其DAD紫外吸收峰范圍。其中2號峰信息與Milbury等[17]、吳子江[29]、李自紅等[30]獲得的蘆丁一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的相關(guān)信息相吻合，3號峰的相關(guān)信息也在Schieber等[31]、Milbury等[17]報道的水仙苷信息中得到驗證，可以推斷2、3號峰物質(zhì)分別為蘆丁和水仙苷。本研究說明該法在中國水仙花瓣類黃酮苷類物質(zhì)的定性分析中具有相對準確、可迅速判斷、得到的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息豐富等優(yōu)勢，較前人研究中國水仙花瓣類黃酮成分中所采用的HPLC法[27]、顯色法[7]更加精確、高效等。

4 結(jié)論

本研究采用了非酸水解法和酸水解法提取中國水仙盛花期花瓣的類黃酮成分，比較了2種方法的優(yōu)缺點。非酸水解法在提取過程中能夠避免類黃酮物質(zhì)糖苷鍵的斷裂，能獲取更多的結(jié)構(gòu)信息，因此該方法較適合用于中國水仙花瓣類黃酮物質(zhì)的提取。此外，本研究首次建立了中國水仙花瓣類黃酮物質(zhì)的HPLC-MSn鑒定方法，為中國水仙花瓣類黃酮成分的定性提供了參考。

參考文獻

[1] 李 玲. 仙客來花色及相關(guān)生理特性的研究[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學， 2012.

[2] 李 麗. 高山杜鵑開花過程中生理生化及花色素的研究[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學， 2010.

[3] 郭春良. 世界水仙花的研究特點[J]. 世界農(nóng)業(yè)， 1990（9）： 52-54.

[4] 曾原飛， 張慧平， 溫 超， 等. 漳州水仙花瓣和副冠類胡蘿卜素成分分析及合成途徑基因表達研究[J]. 熱帶作物學報， 2012， 33（4）： 663-667.

[5] 張慧平. 中國水仙遺傳轉(zhuǎn)化及花色素成分分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2010.

[6] 何炎森. 多花水仙花色相關(guān)基因的分離及功能分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2013.

[7] 羅 鵬. 漳州水仙鱗莖盤轉(zhuǎn)錄組分析及類黃酮合成途徑基因的表達[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2014.

[8] Gomez-Miguez M， Gonzalez-Miret M L， Heredia F J. Evolution of colour and anthocyanin composition of Syrah wines elaborated with pre-fermentative cold maceration[J]. Journal of Food Engineering， 2007， 79（1）： 271-278.

[9] 蔡 欣， 李寶麗， 玉佳男， 等. 純橙汁中類黃酮的RP-HPLC-DAD-ESI-MS2分離鑒定[J]. 核農(nóng)學報， 2014， 28（12）： 2 200-2 207.

[10] 呂 寒， 李維林， 裴詠萍， 等. 枇杷葉中黃酮類化學成分的HPLC-MSn分析[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2009（6）： 56-58.

[11] Cuyckens H， Claeys M. Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids[J]. Journal of Mass Spectrometry， 2004， 39（4）： 461.

[12] 江連洲， 王晰銳， 張 超， 等. HPLC-MS法鑒定不同品種紫甘薯中花色苷組成[J]. 中國食品學報， 2011， 11（5）： 176-181.

[13] 黃 睿， 張貴君， 潘艷麗， 等. 金蓮花化學成分的HPLC-MS表征分析與鑒定[J]. 中草藥， 2012， 43（4）： 670-672.

[14] 袁亞芳， 趙珍珍， 王 威， 等. 紅肉火龍果果皮色素的分離、純化和HPLC-MS分析[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2013， 42（6）： 589-592.

[15] 陳 源. 金柑等柑橘類果實黃酮類化合物提取、純化及分離鑒定[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2011.

[16] Muir S R， Collins G J， Robinson S， et al. Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols[J]. Nat Biotechnol， 2001， 19（5）： 470-474.

[17] Milbury P E， Chen C Y， Dolnikowski G G， et al. Determination of flavonoids and phenolics and their distribution in almonds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（14）： 5 027-5 033.

[18] Wang Y， Chuang Y， Ku Y. Quantitation of bioactive compounds in citrus fruits cultivated in Taiwan[J]. Food Chemistry， 2007， 102（4）： 1 163-1 171.

[19] de Rijke E， Out P， Niessen W M A， et al. Analytical separation and detection methods for flavonoids[J]. Journal of Chromatography A， 2006， 1 112（1-2）： 31-63.

[20] Abdennacer B， Karim M， Yassine M， et al. Determination of phytochemicals and antioxidant activity of methanol extracts obtained from the fruit and leaves of Tunisian lycium intricatum Boiss[J]. Food Chemistry， 2015， 174： 577-584.

[21] Arimboor R， Arumughan C. HPLC-DAD-MS/MS profiling of antioxidant flavonoid glycosides in sea buckthorn（Hippophae rhamnoides L.）seeds[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition， 2012， 63（6）： 730-738.

[22] 羅美紅， 呂 寒，李維林. 枇杷葉中總黃酮含量的高效液相色譜測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2011（3）： 582-583.

[23] 文瑞芝， 楊明生， 劉建莊. 萃取-酸水解法提取純化豆粕中大豆異黃酮甙元[J]. 光譜實驗室， 2004， 21（5）： 925-928.

[24] 鄧少東， 王蓮婧， 林 勵， 等. UPLC法測定酸水解前后化橘紅中4種黃酮類成分的含量[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2012， 27（4）： 924-928.

[25] Bennett R N， Mellon F A， Rosa E， et al. Profiling glucosinolates， flavonoids， alkaloids， and other secondary metabolites in tissues of Azima tetracantha L.（Salvadoraceae）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（19）： 5 856-5 862.

[26] Samanidou V， Tsagiannidis A， Sarakatsianos I. Simultaneous determination of polyphenols and major purine alkaloids in Greek Sideritis species， herbal extracts， green tea， black tea， and coffee by high-performance liquid chromatography-diode array detection[J]. Journal of Separation Science， 2012， 35（4）： 608-615.

[27] 何炎森， 楊碧云， 李 科， 等. 多花水仙花期類胡蘿卜素物質(zhì)和類黃酮物質(zhì)的含量變化[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（3）： 504-510.

[28] 郭繼芬， 陳四平， 喬善義， 等. 黃芩總黃酮提取物的HPLC-MS/MS分析[J]. 藥物分析雜志， 2005， 25（3）： 267-269.

[29] 吳子江. 無花果葉類黃酮提取、 純化、鑒定及抗氧化研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2013.

[30] 李自紅， 魏 悅， 范 毅， 等. 蘆丁的電噴霧離子阱質(zhì)譜分析[J]. 分析試驗室， 2015， 34（2）： 186-189.

[31] Schieber A， Keller P， Carle R. Determination of phenolic acids and flavonoids of apple and pear by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 2001， 910（2）： 265-273.