色胺酮納米膠束的制備及其性質(zhì)研究

張　倩，吳　紅

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，西安　710032)

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·藥劑·

色胺酮納米膠束的制備及其性質(zhì)研究

張倩，吳紅*

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，西安710032)

摘要：目的制備色胺酮納米膠束，改善色胺酮的水溶性，并進(jìn)行體外性質(zhì)考察。方法以二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)為載體，用溶劑揮發(fā)法制備色胺酮納米膠束，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選制備膠束的最佳條件，核磁共振氫譜(1H-NMR)驗(yàn)證色胺酮包載于納米膠束，用芘熒光探針?lè)y(cè)定其臨界膠束濃度(CMC)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其包封率和載藥率，動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定膠束的粒徑，以粒徑、外觀形態(tài)和包封率為指標(biāo)考察膠束的穩(wěn)定性。結(jié)果色胺酮納米膠束的CMC為8.93×10-6mol·L-1，色胺酮與聚合物投藥比為0.442 9∶1(mol∶mol)，真空干燥1 h，水化5 min時(shí)，膠束的包封率為32.24%±1.37%，載藥率為5.468%±0.39%。色胺酮納米膠束平均粒徑為112.5 nm，平均分散系數(shù)為0.208，4 ℃條件下膠束可穩(wěn)定15 d以上。結(jié)論制備色胺酮納米膠束，將色胺酮的溶解度提高至1.625 mmol·L-1，為改善色胺酮生物利用度的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：色胺酮；DSPE-PEG2000；納米膠束；溶解度

色胺酮為吲哚衍生物，主要來(lái)源于馬藍(lán)、菘藍(lán)、蓼藍(lán)等植物，也是微生物的代謝產(chǎn)物[1]。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。色胺酮生物活性廣泛，對(duì)乳腺癌和路易斯肺癌等具有抑制作用[2-3]，并可用于改善過(guò)敏性皮炎[4]，但水溶性不好，在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中溶解度僅為5.4 μmol·L-1[5](1.339 μg·mL-1)，而化合物在水中的溶解度低于100 μg·mL-1時(shí)會(huì)限制其吸收[6]；與其他難溶性抗腫瘤藥物類似，增加給藥次數(shù)會(huì)增強(qiáng)其毒性，因此很難滿足臨床治療的需要[7]。

圖1色胺酮的結(jié)構(gòu)及其編號(hào)

Fig.1 The structure of tryptanthrin and number

聚合物膠束是一種由兩親性聚合物在水溶液中自組裝形成的一種納米藥物載體，親水性片段構(gòu)成膠束的外殼，疏水性片段構(gòu)成膠束的內(nèi)核，形成獨(dú)特的“核-殼”結(jié)構(gòu)[8]。聚合物膠束特有的結(jié)構(gòu)可以將難溶性藥物包封到其疏水性的內(nèi)核，其作為一種載藥系統(tǒng)不僅能夠增加難溶性藥物的溶解度[9]，還具有避免網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞識(shí)別、增加其在血液中的循環(huán)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。目前聚合物膠束是運(yùn)載難溶性藥物最有優(yōu)勢(shì)的載藥體系[10]。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)是一種具有良好的生物相容性和生物降解性的兩親性材料，具有良好的親水性和空間結(jié)構(gòu)[11]。具有生物相容性的高分子材料作為小分子藥物的載體，極大地提高了藥物的利用率[12]。本研究采用DSPE-PEG2000為載體，利用薄膜分散法包封色胺酮得到載藥納米膠束，通過(guò)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)(L934)篩選制備膠束的最佳條件，考察其粒徑、包封率和載藥率等性質(zhì)。

1儀器與試藥

1.1儀器Hei-VAPI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司)；真空干燥箱(大連第四儀器廠)；紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；核磁共振儀(美國(guó)Bruker公司，400 MHz，1H-NMR)；粒度分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；熒光分光光度計(jì)(上海棱光有限公司)。

1.2試藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的色胺酮，由第四軍醫(yī)大學(xué)天然藥物教研室提供；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，購(gòu)自西安瑞禧生物科技有限公司；芘，購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均由西安試劑廠提供。

2方法與結(jié)果

2.1色胺酮納米膠束的制備分別稱取一定量的DSPE-PEG2000和色胺酮，置于25 mL茄形瓶中，加入3 mL三氯甲烷，超聲震蕩使其充分溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使瓶壁上形成均勻薄膜。將其置于真空干燥箱中干燥6 h，除去殘余的三氯甲烷。加入2 mL pH值為7.4的硫化鉛(PBS)溶解薄膜，超聲震蕩20 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾。置于冰箱中4 ℃保存。

2.2色胺酮納米膠束的制備工藝考察采用聚合物與藥物投藥比、真空干燥時(shí)間和水化時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)(L934)，以粒徑、包封率和載藥率為考察指標(biāo)，篩選制備色胺酮納米膠束的最佳條件。

2.3色胺酮納米膠束性質(zhì)的研究

2.3.1臨界膠束濃度(CMC)的測(cè)定采用芘熒光探針測(cè)定色胺酮納米膠束的CMC，配制芘的丙酮溶液，濃度為1×10-8mol·L-1。量取20 μL上述溶液，置于避光處真空干燥。取適量聚合物，配制10組0.1～20 μmol·L-1的水溶液。取聚合物溶液1 mL加入芘中，超聲震蕩1 min，使芘進(jìn)入膠束疏水性內(nèi)核。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為335 nm、發(fā)射波長(zhǎng)范圍為300～450 nm，縫寬為2 nm。最終確定發(fā)射波長(zhǎng)為384 nm， 以373 nm處熒光值I1與384 nm處熒光值I3的比值為縱坐標(biāo)，聚合物濃度為橫坐標(biāo)，觀察I1/I3隨著濃度變化的變化趨勢(shì)。

2.3.21H-NMR驗(yàn)證載藥膠束包封色胺酮參考文獻(xiàn)方法[10]，采用核磁共振氫譜驗(yàn)證色胺酮的包封。分別以CDCl3、D2O為溶劑，表征色胺酮、DSPE-PEG2000，和色胺酮納米膠束的結(jié)構(gòu)。取10 mg色胺酮和DSPE-PEG2000，加入0.5 mL CDCl3，作為對(duì)照；將制備好的色胺酮納米膠束溶液冷凍干燥，得到的固體取2份，每份10 mg，各加入0.6 mL的D2O和CDCl3，掃描核磁共振氫譜。

2.3.3粒徑的測(cè)定動(dòng)態(tài)光散射法(NLS)測(cè)定色胺酮納米膠束的粒度，樣品質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1，測(cè)定溫度為25 ℃。

2.3.4包封率、載藥率和溶解度的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密稱取1.0 mg色胺酮，置于50 mL量瓶中，加入1.0 mL二甲基亞砜，待色胺酮完全溶解后，緩慢加入去離子水，超聲震蕩30 min，使其形成均一相，然后定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的色胺酮母液?；谠撃敢?，配制質(zhì)量濃度為2，4，6，8，10，12，14，16和18 μg·mL-1的色胺酮溶液，使用紫外分光光度計(jì)，在251 nm處測(cè)定其吸光度，建立色胺酮標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.069 53X+ 0.117 5，R2=0.999 5。

取色胺酮納米膠束10 mg，加入400 μL 二甲基亞砜溶液，使用上述方法測(cè)定其質(zhì)量濃度，并計(jì)算膠束的包封率和載藥率。包封率和載藥率的計(jì)算公式為：

(1)

(2)

參照《中國(guó)藥典》溶解度的測(cè)定方法，取色胺酮納米膠束粉末，在25 ℃條件下加入0.8 mL，pH值為 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，振搖30 s，目視其無(wú)可見(jiàn)顆粒。

2.4色胺酮納米膠束穩(wěn)定性考察以正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的制備條件，制備9組載藥膠束。分別考察15 d內(nèi)25和4 ℃條件下膠束的粒徑、外觀形態(tài)和包封率，觀察膠束的穩(wěn)定性。每組平行3個(gè)樣本，求粒徑和包封率的平均值。

2.5色胺酮納米膠束制備工藝的考察見(jiàn)表1。由表1可知，投藥比、真空干燥時(shí)間和水化時(shí)間3個(gè)因素的極差R分別為9.744，1.150和2.748。由此可知，聚合物與藥物的投藥比對(duì)包封率的影響最大，水化時(shí)間次之，而真空干燥時(shí)間為次要因素。

方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，以載藥率為考察指標(biāo)，聚合物與色胺酮的投藥比影響顯著，因此選擇制備條件為:聚合物與色胺酮的摩爾比為0.442 9∶1，由于真空干燥時(shí)間和水化時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)影響，為了節(jié)約時(shí)間，選取真空干燥時(shí)間為1 h，水化時(shí)間為5 min。

表1L934正交實(shí)驗(yàn)篩選色胺酮聚合物膠束的制備條件

Tab.1 Preparation conditions of micelles by L934orthogonal experiments

水平影響因素評(píng)價(jià)指標(biāo)聚合物∶色胺酮/mol∶mol真空干燥時(shí)間/h水化時(shí)間/min粒徑/nm包封率/%載藥量/%10.4429∶111130.524.324.63820.4429∶165123.825.814.90930.4429∶11225110.033.206.22740.8857∶115125.838.523.70950.8857∶1625107.539.413.79260.8857∶1121189.336.753.54571.329∶1125134.339.832.59281.329∶161267.025.611.67991.329∶1125248.026.801.755K115.77010.949.862K211.05010.3810.37K3 6.02611.5312.61R 9.7441.1502.748

表2L934正交實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果

Tab.2 Results of analysis of variance of L934orthogonal design

變異來(lái)源平方和自由度均方F值Fa顯著性投藥比15.827.9037.61F0.05(2,2)=19*干燥時(shí)間0.2220.11水化時(shí)間1.3720.69誤差e0.4220.21總和17.8 8

注：*P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6色胺酮納米膠束性質(zhì)的研究

2.6.1色胺酮膠束的臨界膠束濃度(CMC)的測(cè)定以膠束的濃度為橫坐標(biāo)，以373和384 nm處熒光值之比(I373/I384)為縱坐標(biāo)，繪制曲線，見(jiàn)圖2。由圖2可知，DSPE-PEG2000為載體制備的色胺酮膠束的CMC為8.93×10-6mol·L-1。該值小于一般常用低分子表面活性劑(10-4mol·L-1)[13]，表明該膠束具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性，即稀釋到低濃度依然能維持其膠束的結(jié)構(gòu)[14]。

圖2色胺酮納米膠束的臨界膠束濃度

Fig.2 The CMC of tryptanthrin-loaded nano-micelles

2.6.2核磁共振氫譜驗(yàn)證膠束包封色胺酮見(jiàn)圖3。圖3A為色胺酮的核磁共振氫譜，其中，δ7.4～8.4 ppm為色胺酮的特征吸收峰；圖3B為DSPE-PEG的核磁共振氫譜，其中δ3.6 ppm處為聚乙二醇中“-CH2O-”的特征吸收峰[10]；圖3C和圖3D均為色胺酮納米膠束的圖譜，區(qū)別在于C圖所使用的溶劑為D2O，而D圖使用CDCl3，由于聚乙二醇具有兩親性，故在圖3C和圖3D中均出現(xiàn)其特征峰δ 3.60 ppm，而色胺酮被包封于膠束疏水性內(nèi)核，不溶于水而溶于CDCl3，故色胺酮的特征吸收峰未出現(xiàn)在圖3C而出現(xiàn)在圖3D中。因而證明了色胺酮被膠束包封。

2.6.3膠束粒徑的測(cè)定粒度分析儀測(cè)定膠束的平均粒徑為112.5 nm，分布系數(shù)PDI為0.208，符合正態(tài)分布。

2.6.4包封率、載藥率和溶解度的測(cè)定制備不同投藥比的色胺酮納米膠束，冷凍干燥，加入二甲基亞砜破壞膠束，使用紫外分光光度計(jì)，最大吸收波長(zhǎng)為251 nm，測(cè)定膠束中色胺酮的含量，并根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算包封率和載藥率。以最佳工藝制備色胺酮納米膠束的包封率為322.4%±13.7%，載藥率為5.468%±0.39%。包封量約為322.4±13.7 μg的色胺酮。測(cè)得色胺酮的溶解度為1.625 mmol·L-1。

圖3色胺酮、DSPE-PEG2000和載藥膠束的核磁共振氫譜

A.色胺酮(CDCl3);B.DSPE-PEG2000(D2O); C.色胺酮納米膠束(D2O)；D.色胺酮納米膠束(CDCl3)；1＇～4＇分別為色胺酮上C1～C4上氫的化學(xué)位移值；5＇～8＇分別為色胺酮上C7～C10上氫的化學(xué)位移值；9.DSPE-PEG2000中氫的化學(xué)位移值；10.膠束中DSPE-PEG2000氫的化學(xué)位移值;1～4為膠束中色胺酮C1～C4氫的化學(xué)位移值；5～8為膠束中色胺酮C7～C10氫的化學(xué)位移值

Fig.3 The1H-NMR of Tryptanthrin,DSPE-PEG2000and tryptanthrin-loaded nano-micelles

A.tryptanthrin(CDCl3); B.DSPE-PEG2000(D2O); C.tryptanthrin-loaded nano-micelles(D2O); D.tryptanthrin-loaded nano-micelles(CDCl3)；1＇～4＇hydrogen in C1-C4 chemical shift of tryptanthrin； 5＇-8＇hydrogen in C7-C10 chemical shift of tryptanthrin;9.hydrogen chemical shift of DSPE-PEG2000;10.hydrogen chemical shift of DSPE-PEG2000in micelles; 1-4 hydrogen in C1-C4 chemical shift of tryptanthrin in micelles；5-8 hydrogen in C7-C10 chemical shift of tryptanthrin in micelles

2.7膠束15 d內(nèi)的穩(wěn)定性考察采用透析法，通過(guò)測(cè)定膠束的包封率考察其穩(wěn)定性[15]，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，色胺酮納米膠束在4 ℃，15 d內(nèi)穩(wěn)定性良好；25 ℃時(shí)，7 d內(nèi)膠束亦可以穩(wěn)定存在。

表3色胺酮納米膠束的穩(wěn)定性

Tab.3 The stability of tryptanthrin-loaded nano-micelles

溫度/℃時(shí)間/d粒徑/nm外觀包封率/%40114.5±0.15澄清透明42.327121.8±0.23澄清透明38.2515132.6±0.40澄清透明33.09250110.3±0.25澄清透明42.407124.3±0.43澄清透明36.0815135.3±0.61略有沉淀31.52

3討論

天然產(chǎn)物色胺酮具有良好的生物活性及藥理作用，然而水溶性差限制了其應(yīng)用。目前所使用的增加難溶藥物溶解度的方法有增溶劑和助溶劑，制成可溶性鹽，環(huán)糊精包合，制成脂質(zhì)體等[16]，雖然加入增溶劑和助溶劑等可以有效增加藥物的溶解度，但有些助溶劑的加入會(huì)影響藥物液體制劑的吸收、生理活性和毒性等；制成可溶性鹽的方法僅適用于弱酸性或弱堿性的藥物；包合物的形成與難溶性藥物的極性和環(huán)糊精的立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，利用該技術(shù)時(shí)需要對(duì)其可行性進(jìn)行研究[17]。脂質(zhì)體是將藥物包封于磷脂雙分子層中，但磷脂分子相轉(zhuǎn)變溫度較低，易發(fā)生相轉(zhuǎn)變，且小粒徑脂質(zhì)體容易聚集[18-19]。聚合物膠束體系比表面活性劑穩(wěn)定，能夠較穩(wěn)定地將難溶性藥物包封至其疏水內(nèi)核。

本研究以DSPE-PEG2000為載體，用溶劑揮發(fā)法制備色胺酮納米膠束，并通過(guò)1H-NMR驗(yàn)證色胺酮包封于膠束中。設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表考察色胺酮納米膠束的制備工藝。研究表明，以載藥率為主要考察指標(biāo)，最終確定最佳工藝為聚合物與色胺酮的比例為0.442 9∶1，真空干燥時(shí)間為1 h，水化時(shí)間為5 min。選用該工藝，制備色胺酮納米膠束粒徑為納米級(jí)，分布均勻，包封率為32.24%±1.37%，載藥率5.468%±0.39%。測(cè)定臨界膠束濃度為8.93×10-6mol·L-1，4 ℃下色胺酮納米膠束可穩(wěn)定保存15 d。該方法制備工藝簡(jiǎn)單，方法可靠，將色胺酮溶解度提高至1.625 mmol·L-1，為改善色胺酮生物利用度的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation and characterization of tryptanthrin-loaded nano-micelles

ZHANG Qian，WU Hong*

(Department of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)

Abstract:ObjectiveTo prepare and characterize the tryptanthrin-loaded nano-micelles and improve the solubility of tryptanthrin.Methods1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (polyethyleneglycol)-2000] (DSPE-PEG2000) was used as the carrier to prepare tryptanthrin-loaded nano-micelles. Optimal conditions for preparation of micelles were found through orthogonal experiments. Tryptanthrin-loaded nano-micelles were prepared by using solvent evaporation method. The critical micelle concentration(CMC) of polymer micelles was measured by pyrene fluorescence probe method. The entrapment efficiency and drug loading were charactered by UV spectrophotometry.Size and distribution were evaluated through dynamic light scattering method. Particle size, morphology and encapsulation efficiency were used to investigate the stability of micelles. ResultsThe CMC of tryptanthrin-loaded nano-micelles was 8.93×10-6mol·L-1. When the dosage ratio of copolymer and tryptanthrin was 0.442 9∶1(mol∶mol), vacuum during 1 h, hydration smin,the encapsulation efficiency of micelles prepared under the optimal conditions was 32.24%±1.37%,and the drug loading efficiency was 5.468%±0.39%.The average particle size was 112.5 nm, and the average dispersion coefficient was 0.208. The micelles could be kept for more than 15 d at 4 ℃, indicating excellent stability. ConclusionTryptanthrin-loaded nano-micelles were obtained using solvent evaporation method, the solubility of tryptanthrin in water was improved to 1.625 mmol·L-1.Tryptanthrin-loaded nano-micelles improved its solubility, which laid a foundation for the research of improving its bioavailability.

Key words:tryptanthrin; DSPE-PEG2000; nano-micelles; water-solubility

(收稿日期：2015-10-20)

中圖分類號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)03-0277-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.017

*通信作者：吳紅，女，教授，博士生導(dǎo)師

作者簡(jiǎn)介：張倩，女，在讀碩士研究生

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81271687)