湘葛一號根HPLC指紋圖譜及5種異黃酮含量的同時測定

戴　玲，葉惠煊，鄒親朋，李　芝，劉向前*

(1.長沙博海生物科技有限公司，長沙　410205；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙　410208；3.九芝堂股份有限公司，長沙　410021)

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湘葛一號根HPLC指紋圖譜及5種異黃酮含量的同時測定

戴玲1，葉惠煊2，3，鄒親朋1，李芝2，劉向前2*

(1.長沙博海生物科技有限公司，長沙410205；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙410208；3.九芝堂股份有限公司，長沙410021)

摘要：目的采用高效液相色譜法建立湘葛一號根指紋圖譜，并同時測定5種異黃酮的含量。方法色譜條件:采用AT·LICHROM C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水溶液為流動相進行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為250 nm；柱溫為30 ℃。對不同采收期的10批樣品的圖譜進行測定，運用中國藥典委員會的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件2004AB”進行評價，并對5種異黃酮成分進行含量測定。結(jié)果建立了湘葛一號根HPLC指紋圖譜，各色譜峰分離度良好，確定了7個共有峰，并采用對照品指認了其中5個色譜峰。含量測定條件通過方法學驗證，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的線性范圍分別為5.00～50.00，1.00～10.00，1.82～18.20，1.00～10.00和2.00～20.00 μg·mL-1，線性關(guān)系良好(r>0.999)，平均加樣回收率為98.8%～101.8%，5種異黃酮含量測定結(jié)果可初步確定適宜采收期為12月份。結(jié)論該方法所建立的湘葛一號根指紋圖譜特征性強、方法簡單、結(jié)果可靠，結(jié)合主要有效成分含量測定可更好地用于其質(zhì)量控制，對其鑒定也具有參考價值。

關(guān)鍵詞：異黃酮；湘葛一號；高效液相色譜法；指紋圖譜

野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi和粉葛PuerariathomsoniiBenth的干燥根收載于歷版《中國藥典》，其富含一系列異黃酮類化合物，如大豆苷、葛根素、大豆苷元、染料木苷、染料木素等[1-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，葛根異黃酮具有降血壓、抗氧化、降血糖、抗腫瘤等作用[6-10]。湘葛一號是我國第1個通過雜交選育的葛根新品種，因其具有品質(zhì)好、產(chǎn)量高、抗性強、綜合性狀優(yōu)良等優(yōu)點，故在湖南多地大力推廣栽培和應用。眾所周知，藥材由于采收期的不同，其有效成分的含量不同，發(fā)揮的作用也不同。目前，諸如小葉榕葉[11]、金錢草[12]、裸花紫珠[13]等藥材，通過利用指紋圖譜技術(shù)，標示其特征性的共有色譜峰圖譜，能夠較為全面地反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量，日益成為國內(nèi)外廣泛接受的中藥質(zhì)量評價模式[14-15]。湘葛一號根尚無質(zhì)量控制標準研究，作者采用HPLC法建立了湘葛一號根的指紋圖譜，考察了不同采收期湘葛一號根的質(zhì)量差異，為湘葛一號根的采收及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

目前，大多數(shù)文獻[16-17]采用同時測定葛根中的幾種異黃酮含量來進行質(zhì)量控制，但均需獨立的對照品。且化學對照品大多來自天然產(chǎn)物，具有分離難度大或者單體不穩(wěn)定等問題，這無疑增加了實際工作中的困難。一測多評法是只測定1種易得到成分從而實現(xiàn)對多個成分同步測定的方法，目前已成功運用于丹參[18]、預知子[19]、雙青咽喉片[20]等中藥及中成藥的質(zhì)量控制。本實驗以葛根素為內(nèi)標物，采用一測多評法建立其與大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的校正因子，探討了一測多評法測定湘葛一號根的多成分含量，為湘葛一號根的質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AUW220D分析天平(日本島津公司)；予華HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；FW177中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2材料葛根素、染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元均購于中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)均≥98%，批號依次為110752-200511，111709-200501，111738-200501，111704-200501和111505-200402。湘葛一號根樣品于2011年5～12月及2013年1月和9月采自湖南省常德市湘葛一號種植基地，由湖南天盛生物科技有限公司提供，經(jīng)劉向前教授鑒定為豆科葛屬植物PuerariathomsoniiBenth的干燥根，10批樣品粉碎，過60目篩，備用。甲醇為色譜純試劑；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2指紋圖譜方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：AT·LICHROM C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫，0～10 min，20%～25% A，10～15 min，25%～40% A，15～18 min，40%～46% A，18～25 min，46% A，25～30 min，46%～55% A，30～35 min，55%～65% A，35～45 min，65%～72% A，45～55 min，72%～20% A，55～60 min，20% A；體積流量：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL。

2.2混合對照品溶液的制備稱取對照品葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷，精密稱定，置于同一量瓶中，加適量甲醇，超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為50.00，10.00，18.20，10.00和20.00 μg·mL-1的混合對照品溶液，備用。

2.3供試品溶液的制備取批號201112粉末約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL體積分數(shù)為50%的乙醇，密塞，稱定質(zhì)量，在80 ℃水浴中加熱回流50 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加體積分數(shù)為50%的乙醇補足質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4方法學考察

2.4.1精密度實驗精密吸取批號201112供試品溶液，按照2.1項下色譜條件，重復進樣6次，記錄各色譜圖，計算共有峰相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰的相對峰面積和相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)均小于3%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2重復性實驗取6份批號201112樣品1 g，精密稱定，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定，記錄各色譜圖，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對峰面積和相對保留時間RSD值均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.4.3穩(wěn)定性實驗取批號201112供試品溶液，放置于室溫下，按照2.1項下色譜條件，分別于0，2，4，6，8，12和24 h進樣，記錄各色譜圖，計算其共有峰相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5湘葛一號根指紋圖譜共有模式的建立及相似度評價

2.5.1不同采收期湘葛一號根指紋圖譜的建立精密吸取2.3項下制備的10批次湘葛一號根供試品溶液各10 μL，依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖時間65 min。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004AB版》，將10批湘葛一號根的實驗數(shù)據(jù)導入，設(shè)置參照圖譜，匹配各色譜峰，生成對照圖譜，見圖1。葛根素是湘葛一號根中的特征性成分，故以其為參照峰，選取其中大于3%的7個共有峰作為指紋圖譜的特征峰[21]。10批不同采收期湘葛一號根指紋圖譜相似度計算結(jié)果見表1。

表1不同采收期湘葛一號根指紋圖譜相似度計算結(jié)果

Tab.1 Similarity evaluation on ten batches of roots of Hu′nanPuerariathomsoniiBenth from different harvest periods

批次相似度批次相似度2011050.8872011100.8622011060.5702011110.8252011070.9072011120.8312011080.9822013010.8842011090.8472013090.748

圖1不同采收期湘葛一號根的HPLC疊加圖譜

Fig.1 HPLC of the roots of Hu′nanPuerariathomsoniiBenth from different harvest periods

2.5.2共有峰的標定取2.2和2.3項下方法制備的混合對照品和供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄各色譜峰。結(jié)果見圖2。通過對不同采收期湘葛一號根的HPLC圖進行比較，結(jié)果確定7個共有峰作為其指紋圖譜的特征峰，并指認其中5個峰。

2.5.3不同采收期各有效成分峰面積的變化規(guī)律以2012年5～12月各批次樣品5種異黃酮為指標的總峰面積計算，結(jié)果表明，5～12月樣品總峰面積整體呈現(xiàn)先減后增的規(guī)律，其中5月份總量最高，9月份總量最低。

圖2共有峰標定HPLC圖

A.混合對照品；B.供試品；1.葛根素；2.大豆苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.染料木素

Fig.2 Common peaks of HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.roots；1.puerarin；2.daidzin；3.genistin；4.daidzein；5.genistein

3含量測定方法與結(jié)果

3.1色譜條件按照2.1項下色譜條件進行檢測，以5種對照品計算理論板數(shù)大于3 000，分離度大于1.5。對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖3。

圖3HPLC圖

A.混合對照品；B.供試品；1.葛根素；2.大豆苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.染料木素

Fig.3 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.roots；1.puerarin；2.daidzin；3.genistin；4.daidzein；5.genistein

3.2混合對照品溶液的制備同2.2項。

3.3供試品溶液的制備同2.3項。

3.4線性關(guān)系考察精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，稀釋到不同質(zhì)量濃度，按照2.1項下色譜條件進樣測定。以峰面積和混合對照品質(zhì)量濃度分別為縱坐標和橫坐標進行線性回歸。分別按信噪比的3和10倍考察檢測限和定量限，結(jié)果見表2。

表25種異黃酮成分的線性關(guān)系

Tab.2 Linear equations for five isoflavones

對照品回歸方程r線性范圍/μg·mL-1檢測限/ng·L-1定量限/ng·L-1葛根素Y=2E+07X-1.35210.99945.00～50.000.942.85大豆苷Y=3E+06X+309.050.99921.00～10.000.240.73染料木苷Y=1E+06X+15.9290.99981.82～18.200.481.45大豆苷元Y=6E+06X-2739.40.99981.00～10.000.080.25染料木素Y=1E+07X+158500.99912.00～20.000.040.11

3.5加樣回收實驗取6份批號201112樣品，每份1 g，精密稱定，分別加入適量的混合對照品溶液(相當于葛根素2.70 mg、大豆苷1.80 mg、染料木苷2.30 mg、大豆苷元0.46 mg、染料木素0.06 mg)，按照2.3項下方法制備供試品溶液，依次進樣測定，計算各對照品的平均回收率。葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的平均回收率分別為100.0%，99.1%，98.8%， 100.2%和101.8%，RSD值分別為0.39%，1.77%，0.82%，2.89%和2.32%，見表3。

表3加樣回收實驗結(jié)果

Tab.3 Results of recovery test

(n=6)

3.6不同高效液相色譜儀和色譜柱的相對校正因子(RCF)重復性考察精密吸取2.2項下配制的混合對照品溶液，進樣10 μL，平行重復6次，以葛根素為內(nèi)標物，分別計算大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的RCF值[22]，取均值。實驗考察了Agilent 1200型和Shimadazu LC-10AT型2種高效液相色譜儀及AT·LICHROM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Elite C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Dikma C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱，結(jié)果表明，不同高效液相色譜儀和色譜柱對各成分的RCF值影響不大，結(jié)果見表4。

3.7 色譜峰定位參數(shù)考察由于本實驗使用葛根素作為對照品，需要對大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的色譜峰的位置進行定位，進而達到一測多評的目的。故利用相對保留時間(tk/s)，即待測組分(tk)和內(nèi)標物的保留時間(ts)之比：tk/s=tk/ts，可以定位待測組分。結(jié)果見表5。

表4不同儀器和色譜柱測定RCF值

Tab.4 RCF values of different instruments and chromatographic columns

(n=6)

表5不同儀器和色譜柱的tk/s值

Tab.5tk/svalues of different instruments and chromatographic columns

(n=6)

實驗測得葛根素對大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的相對保留時間(tk/s)的平均值分別為1.169，1.327，1.904和2.213。RSD在0.27%～0.73%之間。表明利用tk/s進行各色譜峰的定位是可行的。

3.8樣品含量測定分別精密吸取10批供試品溶液10 μL，進樣測定。采用外標法和一測多評法分別計算葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，結(jié)果顯示無顯著性差異。見表6。

4討論

4.1色譜條件的選擇本實驗在前期研究工作的基礎(chǔ)上[23]，結(jié)合文獻數(shù)據(jù)[24]，結(jié)果顯示，在250 nm波長處供試品溶液中色譜峰數(shù)目多且基線平穩(wěn)，色譜信息量大，且各色譜峰分離度良好。通過對不同體積流量、不同柱溫、不同進樣量的色譜峰的數(shù)目及分離度比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最佳體積流量為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

表6一測多評法與外標法測定湘葛一號根含量的結(jié)果比較

Tab.6 Comparison of quantitative determination results between single-maker and external standard method

(mg·g-1,n=3)

注：-表示未檢測到。

4.2不同采收期湘葛一號根相似度評價在本實驗條件下，指紋圖譜中各色譜峰的分離度較好，得到了7個共有峰，并指認其中5個峰，結(jié)果全面反映了湘葛一號根的整體化學特征，體現(xiàn)其內(nèi)在整體質(zhì)量。實驗結(jié)果采用均值法生成的對照圖譜，通過相似度軟件評價發(fā)現(xiàn)，僅有201107和201108兩批樣品的相似度大于0.9，說明不同采收期湘葛一號根所含成分及其含量差異較大，可能是不同的氣候條件影響其有效成分的類別和含量。7個特征峰的相對保留時間的RSD均小于3%，符合指紋圖譜的相關(guān)規(guī)定，但其相對峰面積相差很大，表明湘葛一號除了在固定產(chǎn)地的前提下，還需在適宜的采收期采收，才能確保湘葛一號根品質(zhì)的一致性。

4.3湘葛一號最佳采收期的確定通過對不同采收期湘葛一號根的含量測定可知，均含有葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素這5種異黃酮，且5種成分的含量在不同采收期呈現(xiàn)動態(tài)變化。葛根素、大豆苷和染料木苷含量均是5月份最高，9月份最低；大豆苷元和染料木素含量均是7月份最高，9月份最低。雖然湘葛一號根中5種成分總量在5月份相對較高，但是其傳統(tǒng)采收期為秋冬季，此時根的產(chǎn)量最高，5種成分含量也不低。根據(jù)藥用植物適宜采收期的確定原則，當藥用植物的有效成分含量最高時期與產(chǎn)量最高時期不一致時，以兩者乘積最大值的時期作為適宜采收期[25]，因此將湘葛一號根的適宜采收期確定為12月。

4.4一測多評方法的探討由于葛根素是葛屬藥材的主要藥效成分，且在藥材中含量相對較高，對照品穩(wěn)定易得到。故本實驗選用葛根素作為內(nèi)標物，建立該成分與其他4種異黃酮類成分的RCF，從而實現(xiàn)一測多評。實驗中常規(guī)外標法測得的含量與一測多評所測得的葛屬藥材中各成分含量間無顯著性差異，說明一測多評法能夠?qū)崿F(xiàn)葛屬藥材的多成分含量的同步測定。同時，葛根異黃酮的RCF在湘葛一號不同部位及其他不同葛屬品種的成功運用，為一測多評法推廣到其余葛屬藥材及其不同部位的質(zhì)量控制和評價提供了一定的依據(jù)。

5結(jié)論

本文利用指紋圖譜研究及其相似度分析，并結(jié)合有效成分的含量測定，能夠從整體上對湘葛一號進行質(zhì)量評價，快速鑒別湘葛一號根藥材及其最佳采收期，避免了僅僅采用1種或者幾種有效成分含量的高低來片面地評價藥材的優(yōu)劣，為湘葛一號根的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。

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HPLC fingerprint for roots of Hu′nanPuerariathomsoniiBenth and simultaneous determination of five isoflavones

DAI Ling1， YE Huixuan2，3， ZOU Qinpeng1， LI Zhi2， LIU Xiangqian2*

(1. Changsha Broad-Ocean Bio-Science and Technique Limited Company， Changsha 410205， China 2.School of Pharmacy， Hu′nan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 3. Jiuzhitang Limited Company,Changsha 410021， China)

Abstract:ObjectiveAn HPLC fingerprint method for the roots of Hu′nan Pueraria thomsonii Benth in different harvest periods was developed，and quantities of five isoflavones were determined simultaneously. MethodsThe chromatography was performed on an AT·LICHROM C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm) with a mobile phase of methanol-water and gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 250 nm. The column temperature was 30 ℃. The chromatograms of 10 batches of samples in different harvest period was determined by HPLC.ResultsIn the chromatographic fingerprint，7 peaks were selected as the characteristic peaks to assess the similarities of different samples according to similarity evaluation for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine (2004AB). The chemical components contained in the roots of Hu′nan Pueraria thomsonii Benth were effectively separated. Five common fingerprint peaks were labeled from the seven common peaks. In quantitative analysis， the five components showed good regression(r>0.999)， linear ranges of puerarin，daidzin，genistin， daidzein， genistein were 5.00-50.00，1.00-10.00，1.82-18.20，1.00-10.00 and 2.00-20.00 μg·mL-1，and their recoveries were in the range of 98.8%-101.8%，and the optimal harvest period was December.ConclusionThe combination of chromatographic fingerprint and quantitative analysis can be readily used as a quality control method for Hu′nan Pueraria thomsonii Benth.

Key words:isoflavone;Hu′nan Pueraria thomsonii Benth；HPLC；fingerprint

(收稿日期：2015-09-15)

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0239-06

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.006

*通信作者：劉向前，男，教授

作者簡介：戴玲，女，碩士研究生

基金項目：長沙市科技局科技計劃重點項目(編號：K1403122-31)