巨噬細胞活性與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的關(guān)系*

胡玉紅， 宋美玉

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 黑龍江 佳木斯　154002； 2.佳木斯大學 臨床醫(yī)學院， 黑龍江 佳木斯　154003)

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巨噬細胞活性與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的關(guān)系*

胡玉紅1， 宋美玉2

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 黑龍江 佳木斯154002； 2.佳木斯大學 臨床醫(yī)學院， 黑龍江 佳木斯154003)

[摘要]目的： 研究巨噬細胞與子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)發(fā)生之間的關(guān)系。方法： 選取卵巢巧克力囊腫和子宮肌瘤患者各20例，在腹腔鏡下進行手術(shù)治療，術(shù)前分別抽取約15 mL的腹腔液，制成單細胞懸液，運用顯微成像技術(shù)、Cell-sense standard系統(tǒng)、Image J系統(tǒng)測量兩組患者腹腔液中巨噬細胞的運動速度以及子宮內(nèi)膜細胞4 h時面積的變化，并用流式細胞儀檢測腹腔液中表達特異性標記物的巨噬細胞含量；比較兩組患者腹腔積液中CD14+巨噬細胞不同標記物所占百分比差異。結(jié)果： 實驗組巨噬細胞移動速度小于對照組患者巨噬細胞移動速度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組子宮內(nèi)膜細胞面積增長，對照組患者面積減小，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.599，P<0.05)；實驗組患者腹腔液中表達CD69 、CD71 和CD54的巨噬細胞占CD14+巨噬細胞的百分比明顯低于對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論： 巨噬細胞功能的降低可能會引起逆流內(nèi)膜組織在腹腔中形成新的病灶，導致EMT的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]巨噬細胞； 子宮內(nèi)膜異位癥； 移動速度

目前，子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)的病因尚未明。普遍認為是逆流內(nèi)膜組織在各種因素的相互作用下，在除子宮體以外的部位形成新的病灶，其中越來越受關(guān)注的是免疫功能的異常與EMT發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。研究表明，當腹腔免疫功能受損時，隨經(jīng)血逆流的子宮內(nèi)膜細胞在腹腔存活、形成病灶的機會將大大增加[1-3]。腹腔液體中免疫細胞的主要功能為對外來成分具有殺傷作用，而在諸多免疫細胞中，巨噬細胞起主要作用，它具有吞噬功能、抗原呈遞及分泌多種細胞因子等功能，腹腔中巨噬細胞的功能變化可能使內(nèi)膜細胞不能及時被清除，使其順利粘附、侵襲腹膜而形成病灶[4-8]。本研究通過運用顯微成像技術(shù)、免疫標記技術(shù)及流式細胞儀檢測等對EMT患者和子宮肌瘤患者腹腔液中巨噬細胞的移動速度、4 h子宮內(nèi)膜細胞面積變化及腹腔積液中特異標記巨噬細胞量的差異進行比較，來探討巨噬細胞與EMT產(chǎn)生之間的關(guān)系。具體報道如下。

1材料和方法

1.1對象

選取2015年03月～2015年12月卵巢巧克力囊腫和子宮肌瘤患者各20例為研究對象，卵巢巧克力囊腫為實驗組，子宮肌瘤患者為對照組，所有患者25～45歲，平均(25±6.48)歲，均未絕經(jīng)。納入標準：所有患者均符合子宮肌瘤和卵巢巧克力囊腫的診斷標準，且就診前未接受任何治療。排出標準：所有患者均需排除自身免疫性疾病及盆腔炎性疾病，卵巢巧克力囊腫患者未應(yīng)用藥物治療，需行腹腔鏡手術(shù)治療。所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2實驗材料器械

Cellsence standard軟件用于控制顯微鏡對放置于鏡下觀察的腹腔液單細胞懸液拍照，Image J軟件標記巨噬細胞軌跡來測算其速度及測量子宮內(nèi)膜細胞面積，CytoFLEX 流式細胞儀用于檢測細胞特異表型。

1.3實驗分組

根據(jù)實驗設(shè)計，將所有患者分為兩組，卵巢巧克力囊腫患者為實驗組，子宮肌瘤患者為對照組，各20例。實驗組患者行腹腔鏡下卵巢囊腫切除術(shù)，術(shù)中根據(jù)ASRM修正EMT分期法(1997年)對該組患者分期(6例Ⅰ～Ⅱ期，14例Ⅲ～Ⅳ期患者)；對照組患者行腹腔鏡下子宮肌瘤切除術(shù)或子宮切除術(shù)。所有患者在手術(shù)前均抽取約15 mL的腹腔液體(留取樣本后立即實驗)，放入離心機中，2 000 r/min離心5 min，留上清液備用。將腹腔液單細胞懸液置于光鏡下觀察，巨噬細胞形態(tài)多呈圓形或橢圓形，功能活躍著有偽足，較其他細胞形體較大，移動速度相對慢。

1.4檢測指標

選取具有巨噬細胞和(或)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的視野，用Cellsence standard軟件對顯微鏡設(shè)置為4 h內(nèi)每2 min拍照1次該視野。運用Image J軟件及Manual-Tranking插件標記圖片中巨噬細胞軌跡并計算出巨噬細胞運動速度，用Photoshop軟件分析照片的實際尺寸及像素，計算得出1.5像素代表實際1 μm，以此為比例在Image J軟件中設(shè)標尺，測量子宮內(nèi)膜細胞的面積，通過巨噬細胞移動速度和4 h內(nèi)面積的變化來表示巨噬細胞功能及腹腔液中相關(guān)細胞因子對EMT的作用效果。腹腔液中巨噬細胞的表型運用雙色免疫熒光進行標記，使用的抗體有anti.CD14(單核細胞/巨噬細胞的標記物，PE.conjugated)，anti.CD69(早期激活分子，F(xiàn)ITC.conjugated)，anti.CD54 (細胞間黏附分子1，intercellular adhesion molecule.1/ICAM.1，F(xiàn)ITC.conjugated)，anti.CD71 (增殖標記物，F(xiàn)ITC.conjugated)。所有抗體均購于北京安必維(Abway)抗體技術(shù)有限公司。用的流式細胞儀為CytoFLEX 流式細胞儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司)檢測腹腔積液中CD14+巨噬細胞不同標記物所占百分比。

1.5統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1巨噬細胞移動速度

分析兩組患者樣本圖片所得的數(shù)據(jù)，實驗組巨噬細胞移動速率小于對照組患者巨噬細胞移動速度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1　兩組患者腹腔液中巨噬細胞移動速度

注：圖中*與·為離群值圖1　不同分組巨噬細胞移動速度比較Fig.1　the macrophages' movement rate of different groups

2.2兩組患者腹腔積液樣本中子宮內(nèi)膜細胞面積變化測定及分析

運用統(tǒng)計軟件測量4 h子宮內(nèi)膜細胞面積變化，以增長為正值，減小為負值，其計量資料不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗進行分析，實驗組子宮內(nèi)膜細胞面積增長明顯大于對照組患者(Z=-4.599，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表2和圖2。

表2　兩組子宮內(nèi)膜細胞面積差值比較

注：兩組患者的表中數(shù)值為對應(yīng)視野中對應(yīng)標記物巨噬細胞數(shù)與CD14+巨噬細胞的比值

2.3流式細胞儀檢測兩組患者腹腔積液中CD14+巨噬細胞標記物的差異

實驗組患者腹腔液中表達CD69 、CD71 和CD54的巨噬細胞占CD14+巨噬細胞的百分比明顯低于對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表3。

注：A1為實驗開始內(nèi)膜細胞，B1為4 h后內(nèi)膜細胞，A2為實驗開始內(nèi)膜細胞，B2為4 h后內(nèi)膜細胞圖2　兩組子宮內(nèi)膜細胞面積的變化Fig.2　The ares difference of endometrial cells in observation and control group

標記物對照組實驗組PCD6925.6±6.014.3±5.6<0.05CD7124.0±2.36.1±1.7<0.05CD5447.5±13.518.1±3.1<0.05

3討論

EMT是指子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的部位，該病好發(fā)于育齡婦女，易復發(fā)，是具有惡性腫瘤侵襲性的良性疾病，易引起女性不孕、慢性骨盆疼痛(35%～50%)等嚴重影響女性心理和生理健康，降低生活質(zhì)量。研究表明，70%～90%育齡婦女的經(jīng)血或早卵泡期的腹腔液中均可見存活的子宮內(nèi)膜細胞，但只有10%～15%的女性發(fā)病[8-13]。因此，EMT的發(fā)生除與異位種植有關(guān)外，還可能與腹腔清除外源細胞的能力密切相關(guān)。異位種植理論(也稱經(jīng)血逆流理論)是指女性月經(jīng)期的子宮內(nèi)膜碎片隨經(jīng)血自子宮經(jīng)輸卵管排入腹腔，粘附到腹膜表面發(fā)展成為子宮內(nèi)膜異位癥。但在一般情況下，健康女性的免疫系統(tǒng)能夠清除外來抗原，可以防止外源細胞的植入與生長；而在各種因素的影響下，腹腔清除外源細胞能力降低時可能使內(nèi)膜組織經(jīng)逆行的經(jīng)血流入腹腔并存活，最終發(fā)展成新的病灶。腹腔清除外源細胞能力主要與腹腔免疫細胞密切相關(guān)，主要包括巨噬細胞、淋巴細胞、NK細胞等。腹腔液中的免疫細胞以單核細胞為主，因此子宮內(nèi)膜細胞進入腹腔后遇到的第一道防線主要為腹腔巨噬細胞[14-18]。正常生理情況下，巨噬細胞具有相應(yīng)的免疫活性，能夠清除異位的子宮內(nèi)膜組織；然而EMT患者巨噬細胞的功能處于低靡狀態(tài)，大大增加了異位的子宮內(nèi)膜組織粘附和浸潤的機會。

本研究中，抽取腹腔液檢測巨噬細胞的運動軌跡并檢測其運動速度發(fā)現(xiàn)，EMT患者腹腔液中的巨噬細胞運動速度較為緩慢，同時細胞的形態(tài)學特征也顯示細胞無明顯的偽足，功能不活躍；此外，用anti.CD14對所有巨噬細胞進行標記，檢測巨噬細胞激活、粘附時表達的分子標記物CD69、CD71 和CD54，發(fā)現(xiàn)EMT患者的腹腔液中CD69、 CD54和CD71處于低表達狀態(tài)，CD69、CD54和CD71的CD14+細胞百分明顯低于子宮肌瘤組。腹腔中的巨噬細胞來源于外周血，受細胞因子作用逐漸趨化至腹腔中，此過程中巨噬細胞會表達對應(yīng)的激活、粘附、遷徙分子；相反，這些分子標記物表達量的增加或者降低也提示了巨噬細胞的功能狀態(tài)。本研究中，巨噬細胞無論是從子宮內(nèi)膜細胞面積，或者巨噬細胞運動速度，還是從其表達的黏附、激活分子標記物上來看，巨噬細胞功能均處于低靡狀態(tài)。正常巨噬細胞功能的發(fā)揮是清除異位的子宮內(nèi)膜組織的關(guān)鍵，其功能降低很可能導致EMT的產(chǎn)生。當腹腔免疫功能發(fā)生變化，尤其是巨噬細胞功能受損時，使進入腹腔的子宮內(nèi)膜細胞不被機體的免疫殺傷作用清除[16，19-22]；同時巨噬細胞本身分泌一些細胞因子如IL.1、IL.6、IL.8、TNF.a、前列腺素、血小板活化因子、血管生長因子、巨噬細胞移動抑制因子等導致腹腔微環(huán)境發(fā)生改變[2-3，9-10]；尤其是巨噬細胞移動抑制因子，作用于巨噬細胞抑制其移動，使病灶和腹腔液內(nèi)的巨噬細胞數(shù)量增多，還能促進巨噬細胞分泌功能增強，使巨噬細胞向內(nèi)膜細胞游走募集的速度降低，影響其吞噬功能同時又增加異位內(nèi)膜侵襲性、促進其生長并且加重局部炎性反應(yīng)的作用，促進其在腹腔內(nèi)種植生長，最終形成病灶，這可能是該病發(fā)病的主要病理機制[4-11，23-25]。

綜上所述，巨噬細胞的清道夫功能減弱或缺陷時不能有效清除異位子宮內(nèi)膜細胞，可能是導致子宮內(nèi)膜異位癥重要原因；而對巨噬細胞的功能進行靶向調(diào)節(jié)可能是防止子宮內(nèi)膜異位癥出現(xiàn)的有效途徑。

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(2016-01-08收稿，2016-04-07修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 周凌

The Correlation between Macrophage Activity and Endometriosis

HU Yuhong1, SONG Meiyu2

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology, 1stAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,Heilongjiang,China;2.ClinicalMedicineCollege,JiamusiUniversity,Jiamusi154003,Heilongjiang,China)

[Abstract]Objective: To study the relationship between macrophages and endometriosis. Methods: Twenty patients with ovarian chocolate cysts and 20 patients with uterine fibroids were selected; all patients underwent laparoscopic surgery. Approximately 15 mL peritoneal fluid was extracted before operation and single cell suspension was made. The microscopic imaging technique, Cell-sense standard system and Image J system were used to examine the trajectory, velocity of macrophages, as well as the changes in areas of endometrial cells within 4 hours. The ratio of macrophages expressed specific immunological markers measured by the flow cytometry was also calculated. The indicators mentioned above were collected and compared between the two groups. Results: The rate of macrophage movement of experimental group was lower than that in control group (P<0.05); the growth of endometrial cell areas of in experimental group was significant higher than that in control group (Z=-4.599, P<0.05); and the ratio of macrophages expressed specific immunological markers of CD69, CD71 and CD54 was statistically lower than that in control group (P<0.05). Conclusion: The decrease of macrophage function may cause a backflow of endometrial tissue to form new lesions in the abdominal cavity, causing EMT.

[Key words]macrophage; endometriosis; movement speed

[中圖分類號]R783.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0418-05

*[基金項目]佳木斯大學重點科技項目資助，項目編號(Sz2014-008)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1757.010.html