丹參酮Ⅱ-A對大鼠成骨細胞體外增殖分化的影響*

莫朝倫， 張軍梅*， 賈　瑩， 王藪馨， 吳　憂， 劉　秒， 張鳳丹

(貴州醫(yī)科大學附院 口腔科， 貴州 貴陽　550004)

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丹參酮Ⅱ-A對大鼠成骨細胞體外增殖分化的影響*

莫朝倫**， 張軍梅***， 賈瑩， 王藪馨， 吳憂， 劉秒， 張鳳丹

(貴州醫(yī)科大學附院 口腔科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究丹參酮Ⅱ-A(TsII-A)對大鼠成骨細胞(OB)體外增殖分化的影響。方法： 分離、培養(yǎng)、純化SD乳鼠顱蓋骨OB，選擇傳代至第3代的OB進行細胞形態(tài)學鑒定；將第3代OB分為實驗組及對照組，實驗組給予5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L TsII-A處理，對照組OB加入與實驗組等量的完全培養(yǎng)基DMEM；于接種后第1、3、5、7天4個時間點觀察TsII-A對OB增殖的影響；于接種后第5天檢測OB中堿性磷酸酶(ALP)活性。結果： 分離、培養(yǎng)所得的細胞符合OB的形態(tài)學特征；與對照組比較，實驗組不同濃度TsII-A對OB均有促增殖的作用(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最大；培養(yǎng)OB至第5天時實驗組中ALP活性高于對照組(P<0.05)。結論: TsII-A在一定的作用時間內，對體外培養(yǎng)的OB具有促增殖分化作用。

[關鍵詞]丹參酮Ⅱ-A； 成骨細胞； 堿性磷酸酶； 增殖分化； 正畸學； 牙移動

適宜的正畸矯治力通過牙作用于牙周組織后，誘導壓力側牙槽骨破細胞(osteoclast，OC)的形成和骨吸收，促進張力側成骨細胞(osteoblast，OB)新生和新骨沉積，形成骨塑建，最終導致正畸牙移動。OB是骨塑建的物質基礎,它來源于具有多向分化潛能的間充質干細胞，可分泌一系列骨蛋白，包括堿性磷酸酶(akaline phosphatase，ALP)和多種細胞外基質蛋白，如骨鈣素、骨橋蛋白、骨延蛋白和Ⅰ型膠原等，并通過分泌一些細胞因子參與骨形成過程，同時控制骨基質的礦化過程，說明OB是骨組織更新活動中最重要的功能細胞和效應細胞[1]。ALP是OB成熟的重要標志酶之一 ，定量檢測ALP的活性可以客觀地反映OB的分化水平。丹參屬活血化淤類傳統(tǒng)中藥，具有改善OB的功能，促進骨折愈合[2]；丹參亦可促進正畸牙移動中牙槽骨的塑建和調整，加速正畸牙移動[3-5]。丹參酮Ⅱ-A(tanshinone Ⅱ-A，TsⅡ-A)屬于丹參的有效活性成分，具有心血管藥理作用、雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[6]。本實驗應用TsⅡ-A作用于體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠OB，探討TsⅡ-A對OB增殖分化的作用及其對正畸牙移動中骨塑建的影響。

1材料和方法

1.1材料

TsII-A購于Aladdin-阿拉丁試劑(上海)有限公司。新生SD大鼠乳鼠，體質量7～8 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(黔)2012-0001]提供。DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone， 美國)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，青/鏈霉素雙抗(北京索寶萊生物科技有限公司)，0.1%Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國)，Cell counting Kit8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁)，ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)，茜素紅指示劑(北京索寶萊生物科技有限公司)。超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(MCO-18AIC型，Sanyo，日本)，離心機(HC-2062)，倒置相差顯微鏡(XD-101型，江南公司)及全自動酶標儀(Bio-rad-680)。

1.2方法

1.2.1OB分離培養(yǎng) 、傳代純化及鑒定將新生的SD大鼠顱蓋骨剪成碎骨片，通過酶消化法提取原代OB，并利用差速貼壁法純化OB至第3代[7]。通過形態(tài)學觀察、ALP染色(鈣鈷法)和茜素紅染色對獲得的OB進行鑒定。

1.2.2TsⅡ-A濃度篩選采用CCK-8試劑比色篩選最適宜的TsⅡ-A濃度，第3代OB以2×107個/L密度的細胞懸液接種于96孔板(1×10-4L/孔)。實驗組設置為5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L 3個濃度，對照組僅加入與實驗組等量的完全培養(yǎng)基DMEM，各組均設4個復孔；于接種后第1、3、5、7天4個時間點觀察。

1.2.3成骨細胞數(shù)量在各時間點，各組待測細胞均用CCK-8溶液(1×10-5L/孔)孵育2 h后，于酶標儀450 nm處讀取OD值。

1.2.4ALP活性第3代OB以5×105個/孔的密度接種于6孔板，依據CCK-8試劑盒比色試驗篩選出最適宜的TsⅡ-A濃度作為實驗組，對照組僅加入等量完全培養(yǎng)基DMEM,各組設5個復孔。各組培養(yǎng)至第5天，吸取培養(yǎng)液，1 500 r/min離心10 min取上清液，用ALP試劑檢測ALP活性，于酶標儀520 nm處讀取OD值。以金氏單位(0.1 L液體在37 ℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個金氏單位)表示其活性，計算公式：

ALP活力=測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值×酚標準品濃度(0.02 g/L)×0.1 L×樣本稀釋倍數(shù)

1.3統(tǒng)計學分析

2結果

2.1成骨細胞鑒定

倒置相差顯微鏡下：原代細胞貼壁生長，呈梭狀、三角形、不規(guī)則形，可見數(shù)量不等、長短不一的突起，部分區(qū)域呈重疊、放射生長(圖1A)；第3代細胞體積增大，胞質豐富，細胞突起伸展呈梭形、不規(guī)則形等典型的OB形態(tài)(圖1B)；ALP染色見胞質中含灰黑色顆粒或條塊狀沉淀，胞核染成藍紫色(圖1C)；茜素紅染色見連續(xù)培養(yǎng)至第21天的第3代OB融合呈疊狀生長，形成的鈣結節(jié)，染色呈橘紅色(圖1D)。

注：A為原代OB培養(yǎng)第5天，B為第3代OB培養(yǎng)第5天，C為第3代OB ALP染色，D為第3代OB培養(yǎng)至第21天茜素紅染色圖1　體外培養(yǎng)的OB形態(tài)學觀察及鑒定(100×)Fig.1　The morphological observation and identification of osteoblasts cultured in vitro

2.2TsⅡ-A對OB增殖的影響

CCK-8檢測結果顯示，各實驗組TsⅡ-A均可促進OB增殖；與對照組比較，5×10-2mg/L、5×10-1mg/L濃度組在第1 、3 、5 天對OB的促增殖作用顯著(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最為顯著；5×10-3mg/L濃度組在第3 、5 天對OB的促增殖作用顯著(P<0.05)；各實驗組在第7 天時間點對OB的促增殖作用與對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　不同濃度TsII-A對OB增殖的影響(OD值，

(1)與對照組比較，P<0.05

2.3ALP活性

對照組及實驗組比較，培養(yǎng)OB至第5天時實驗組中ALP活性高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2　TsII-A對ALP活性的影響

3討論

丹參提取于唇形科鼠尾草屬植物的干燥根及根莖，是活血化淤類傳統(tǒng)中藥，常用于骨折治療，具有強骨補腎的作用，是中醫(yī)骨傷科方劑中的常用藥。丹參可提高大鼠OB的ALP活性，對OB具有促細胞增殖和分化的作用[8]。相關研究表明丹參亦可加強成骨細胞樣細胞合成和分泌骨質基質，從而促進鈣鹽沉積及骨組織形成，加快骨折的愈合速度[9]。TsII-A是丹參中主要有效成分之一,為脂溶性櫻紅色針狀結晶，除具備傳統(tǒng)的活血調經、祛瘀止痛、養(yǎng)心安神之功效外，還具有抗腫瘤、天然抗氧化、心血管藥理作用、雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[6]。有學者研究發(fā)現(xiàn) ，TsII-A在BMP-2 誘導下，能促進雙潛能間充質前體細胞C2C12分化為OB[10]。

目前，相關研究確認OB富含ALP，具有長時間體外培養(yǎng)能發(fā)生礦化、形成鈣結節(jié)、表達骨鈣素等典型特征，是長期以來作為OB鑒定的主要依據。本實驗采用酶消化法獲取大量SD大鼠乳鼠顱蓋骨的OB，通過細胞形態(tài)觀察、ALP染色(鈣鈷法)和鈣結節(jié)染色鑒定，結果顯示SD大鼠乳鼠顱蓋骨體外分離培養(yǎng)出的細胞具有OB典型的形態(tài)學及生物學特征，符合本實驗研究需要。CCK-8法是用于測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數(shù)目的一種無放射性的比色檢測法，CCK-8試劑可直接加入到細胞樣品中，具有操作簡易、敏感度高、結果客觀可靠等優(yōu)點。本實驗采用CCK-8法檢測在不同濃度TsII-A的作用下對OB體外增殖的影響，結果顯示，5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L濃度的TsII-A均可促進OB增殖，其中5×10-2mg/L濃度組促細胞增殖作用最明顯，說明該藥物濃度為本實驗最適宜作用濃度，提示適宜濃度TsII-A具有促進體外培養(yǎng)的SD大鼠乳鼠顱蓋骨OB增殖的作用。ALP是OB成熟的重要標志酶之一 ，定量檢測ALP的活性可以客觀地反映OB的分化水平，ALP活性越高，說明OB分化越成熟，本實驗ALP活性檢測結果顯示，對照組及實驗組比較，培養(yǎng)OB至第5天時實驗組中ALP活性高于對照組(P<0.05)，提示了TsII-A對OB具有促進細胞分化成熟作用。

近年來有學者把TsII-A應用到探討加速正畸牙移動機理研究中,楊夏晴等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在家兔正畸牙移動過程中，口腔局部注射適量TsII-A可有效的促進牙槽骨改建，從而加快正畸牙移動速度?？谇徽委煹纳飳W基礎主要體現(xiàn)在頜骨及牙槽骨的可塑性，即頜骨及牙槽骨的增生和吸收兩個過程。正畸牙的移動過程中，骨組織的塑建最為重要[12]，骨塑建的快慢直接影響著牙齒移動速度，以致影響到正畸矯治療程。正畸矯治力作用下牙槽骨的改建和骨折愈合中骨的改建同樣涉及到OB新生和新骨沉積，OB的發(fā)生、增殖、分化和成熟與頜骨、牙槽骨塑建密切相關。本實驗初步研究了TsII-A對OB的直接作用，結果表明，適宜濃度的TsII-A在一定的作用時間內，對體外培養(yǎng)的OB具有較明顯的促增殖分化作用，說明TsII-A可能通過促進OB增殖分化和成熟來達到促進骨改建，從而影響正畸牙齒的移動，這為正畸治療過程中加速牙移動的臨床研究奠定了理論基礎。TsII-A促進OB增殖分化的具體機制有待進一步深入研究。

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(2016-01-08收稿，2016-03-21修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Effect of Tanshinone Ⅱ-A on Proliferation and Differentiation of Rats' Osteoblastinvitro

MO Chaolun, ZHANG Junmei, JIA Ying, WANG Souxin, WU You, LIU Miao, ZHANG Fengdan

(DepartmentofStomatology,theAffiliatedHispitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Tanshinone Ⅱ-A(TsII-A) on the proliferation and differentiation of rat osteoblast(OB) in vitro. Methods: Infant rats' calvarial OB were isolated, cultured and purified in vitro, and passed to the third generation. The morphological changes and physiologic characters of the third generation OB were observed by inverted microscope. The third generation OB were divided into experimental group and control group. The experimental group was treated by different concentrations of TsII-A while control group were given equal amounts of pure DMEM culture medium. Then the effects of TsII-A on the proliferation and differentiation of rats' OB on the 1stday, the 3rdday, the 5thday, and the 7thday, were observed respectively. The alkaline phosphatase (ALP) activities of OB were determined 5 days after inoculation. Results: The morphological characters of isolated and cultured cells accorded with those of OB. Different concentrations of TsII-AT had significant promotion effects on OB proliferation, of which the 5×10-2mg/L of TsII-AT showed the maximum promotion effect (P<0.05). The ALP activities of experimental group were significantly higher than those of control group 5 days after inoculation (P<0.05). Conclusion: TsII-A has the promotion effect on OB proliferation and differentiation in vitro within certain period of time.

[Key words]tanshinone Ⅱ-A; osteoblast; alkaline phosphatase; proliferation and differentiation; orthodontics; tooth movement

[中圖分類號]R783.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0391-04

*[基金項目]貴陽市科技局基金[筑科合同(20151001)]

**貴州醫(yī)科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

網絡出版時間：2016-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1811.022.html