納米載體介導(dǎo)沉默Survivin基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞增殖凋亡及放療敏感性的影響*

鄧　雯， 孫茂鋼， 趙　艷， 趙厚育

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽　550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽　550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽　550004)

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納米載體介導(dǎo)沉默Survivin基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞增殖凋亡及放療敏感性的影響*

鄧雯1， 孫茂鋼1， 趙艷2， 趙厚育3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討納米載體轉(zhuǎn)染沉默鼻咽癌CNEII細(xì)胞中Survivin基因后，CNEII細(xì)胞增殖、凋亡及對放療敏感性的改變。方法： 制備聚乙烯亞胺(PEI)-四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米粒，用PEI-Fe3O4磁性納米粒包被miRNA-Survivin質(zhì)粒(納米干擾質(zhì)粒)，將CNEII細(xì)胞分為空白對照組(不加質(zhì)粒，C組)、加納米干擾質(zhì)粒組(S組)及加miRNA-NC對照質(zhì)粒組(NC組)；3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒所帶綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；利用Real Time RT-PCR及Western Blot方法檢測Survivin mRNA及蛋白表達(dá)抑制情況；轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h時(shí)用MTT法檢測3組細(xì)胞的增殖情況，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)用放射線照射3組，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測3組細(xì)胞放射線照射前后的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果： 轉(zhuǎn)染48 h后，加入包被miRNA-Survivin質(zhì)粒的PEI-Fe3O4磁性納米粒的CNEII細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為(60.9±3.9)%、mRNA表達(dá)抑制率為96.5%、蛋白表達(dá)抑制率為82.5%，均高于C組和NC組(P<0.05)，說明構(gòu)建PEI-Fe3O4磁性納米粒成功；MTT結(jié)果顯示48 h以后S組細(xì)胞的吸光度值低于NC組和C組，說明細(xì)胞增殖被抑制；轉(zhuǎn)染48～72 h CNEII細(xì)胞施以6Gy的放射線照射，射線照射后S組細(xì)胞凋亡率高于S組照射前(P<0.05)，S組細(xì)胞凋亡率高于NC組和C組(P<0.05)。結(jié)論： 鼻咽癌CNEII細(xì)胞沉默Survivin基因后的細(xì)胞的增殖被抑制、凋亡數(shù)增加，放射線照射凋亡更明顯。

[關(guān)鍵詞]鼻咽癌； Survivin基因； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 放療敏感性

鼻咽癌是中國常見的惡性腫瘤之一，以南方地區(qū)為主，是頭頸部惡性腫瘤的首位。目前臨床上放射治療鼻咽癌多采用調(diào)強(qiáng)放射治療，患者的5年生存率為70%[1]，但仍有部分患者經(jīng)放射治療后不能得到滿意效果，如何提高鼻咽癌的放射敏感性已成為目前臨床治療的難點(diǎn)和研究的重點(diǎn)。凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)不僅與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，而且在輻射誘導(dǎo)的凋亡中也可能扮演著重要的角色。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中一員，Survivin的表達(dá)過度會(huì)使細(xì)胞失去正常細(xì)胞周期的調(diào)控限制而大量無限增殖，正常的細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡被打破，造成細(xì)胞凋亡減少。由于Survivin特異性表達(dá)于惡性腫瘤組織且具有強(qiáng)大的抑制凋亡活性，已成為倍受關(guān)注的抗腫瘤治療的靶點(diǎn)[2]。本研究采用新型非病毒載體聚乙烯亞胺(poly ethylene imine,PEI)-四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米粒介導(dǎo)沉默鼻咽癌CNEII細(xì)胞中的survivin基因，觀察沉默后CNEII細(xì)胞的凋亡、增殖及放療敏感性的變化，為鼻咽癌的基因治療提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1質(zhì)料、試劑及儀器

干擾質(zhì)粒購于上海吉瑪公司，miRNA-HIF-1α干擾質(zhì)粒的靶序列為5′-AAGGATTTAGGCCACTGCCTT-3′，NC對照質(zhì)粒的靶序列為5′-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3′，各質(zhì)粒均帶有EGFP綠色熒光；鼻咽癌細(xì)胞株CNEII由上海復(fù)旦大學(xué)亓立峰教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與。試劑有FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、PEI購于上海朗順化工有限公司，RP1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于Invitrogen公司，Survivin抗體、Tubulin抗體及相關(guān)二抗均購于美國ABcam公司，小RNA(microRNA,miRNA)干擾質(zhì)粒購于上海吉瑪公司，PCR試劑盒購于Invitrogen公司，AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒購于碧云天公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購于Sigma公司。儀器有恒溫水浴鍋，電子稱量器，機(jī)械攪拌器購于德國Memmert公司，電泳儀及垂直電泳槽購于美國BioRad公司，熒光顯微鏡購于OLYMPUS公司，高速離心機(jī)購于Eppendorf公司，RT-PCR儀購于美國Biorad公司，流式細(xì)胞儀購于BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將CNEII細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的RP1640培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。將培養(yǎng)好的CNEII細(xì)胞分為空白對照組(不加質(zhì)粒，C組)、加合成的納米顆粒PEI-Fe3O4轉(zhuǎn)染miRNA-Survivin干擾質(zhì)粒組(S組)及轉(zhuǎn)染miRNA-NC對照質(zhì)粒組(NC組)；在細(xì)胞生長良好的情況下，以約1×105密度接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁，密度達(dá)40%時(shí)利用轉(zhuǎn)染介質(zhì)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒。

1.2.2PEI-Fe3O4納米載體的制備取8 mmoL 水楊酸與10 mL水混合，用1 mol/L NaOH中和水楊酸，并調(diào)PH值為11。稱取FeCl20.254 g，F(xiàn)eCl30.65 g，分別溶于5 mL水。將FeCl2、FeCl3溶液加入到配置好的水楊酸溶液中，溶液變成黑色，在氮?dú)獗Ｗo(hù)，冷凝回流，機(jī)械攪拌，90 ℃條件下反應(yīng)4 h。吸取PEI 6.0 g，用10 000透析袋透析2 d，每4～5 h換1次水，透析除去雜質(zhì)。最后收得25 000 PEI 9.25 mmol/L。取PEI 10 mmol/L：Fe3O41 mol/L等體積渦旋混勻，即得PEI-Fe3O4納米載體。

1.2.3轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒所帶綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4轉(zhuǎn)染后Survivin mRNA表達(dá)抑制率采用Real Time RT-PCR，設(shè)計(jì)Survivin基因擴(kuò)增引物，上游序列為5′-ACCGCATCTCTACATTCAAG-3′，下游序列為5′-TTGAAGCAGAAGAAACACTG-3′。CNEII細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h收集細(xì)胞，提取總RNA，以β-actin作為對照。RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s、 60 ℃ 10 s、70 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)；70 ℃ 10 min。實(shí)時(shí)熒光定量檢測轉(zhuǎn)染后Survivin mRNA表達(dá)，計(jì)算抑制率，抑制率=(C組2-ΔΔCT值-S組2-ΔΔCT值)/C組2-ΔΔCT值×100%。

1.2.5轉(zhuǎn)染后Survivin蛋白表達(dá)抑制率采用Western Blot法檢測，在轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞，常規(guī)PBS洗滌后提取蛋白，12%及8%聚丙酰胺凝膠恒壓分離蛋白，常規(guī)轉(zhuǎn)膜及封閉后加入Survivin一抗(1∶5 000)和Tubulin(內(nèi)對照)一抗(1∶5 000)4 ℃過夜孵育，經(jīng)過常規(guī)TBST洗滌后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，顯影、定影、洗滌后觀察結(jié)果，計(jì)算抑制率，抑制率=(C組相對灰度值-S組相對灰度值)/C組相對灰度值×100%。

1.2.6轉(zhuǎn)染后CNEII細(xì)胞的增殖采用MTT法，培養(yǎng)對數(shù)生長期的CNEII細(xì)胞，PBS溫柔清洗3次，用適量胰酶消化，1640全培養(yǎng)基重懸后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，每孔按5×103細(xì)胞密度接種于96孔板上，培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，質(zhì)粒用量0.2 μg，納米材料25000 PEI-Fe3O4用2 μL。轉(zhuǎn)染6 h后換液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗細(xì)胞2遍后，加入含MTT的培養(yǎng)液。每孔加入MTT染色液50 μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。后每孔加入DMSO 100 μL，在搖床上輕輕振蕩20 min。放入酶標(biāo)儀中，在570 nm處測定吸光度值。利用吸光度值反映CNEII細(xì)胞的增殖(吸光度值越高細(xì)胞增殖越好)。

1.2.7細(xì)胞凋亡采用流式細(xì)胞術(shù)，轉(zhuǎn)染48～72 h的CNEII細(xì)胞，PBS清洗3次，用適量不含EDTA胰酶消化1 min，加入含10%FBS 的RP1640培養(yǎng)基，輕輕吹打后收集細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清后在洗滌細(xì)胞1次，將剩下的細(xì)胞用5 00 μL binding buffer 重懸。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入10 μL Propidium lodide，混勻。室溫避光5～15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀CNEII細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8放射線照射細(xì)胞后CNEII細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染48～72 h CNEII細(xì)胞用 6Gy的放射線照射，按1.2.6步驟檢測CNEII細(xì)胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1構(gòu)建PEI-Fe3O4磁性納米粒的鑒定

轉(zhuǎn)染48 h后，加入納米粒干擾質(zhì)粒的CNEII細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為(60.9±3.9)%、mRNA表達(dá)抑制率為96.5%(表1)、蛋白表達(dá)抑制率為82.5%(圖1)，均高于C組和NC組(P<0.05)，說明構(gòu)建PEI-Fe3O4磁性納米粒成功。

表1　MTT法測定3組CNEII細(xì)胞吸光度值

(1)與S組比較，P<0.05

圖1　3組CNEII細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)Survivin蛋白表達(dá)Fig.1　Survivin protein levels of CNEII cells in the three groups after transfection for 48 h

2.2轉(zhuǎn)染后CNEII細(xì)胞的增殖

分別用miRNA-Survivin、miRNA-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNEII細(xì)胞，S和NC組吸光度低于C組，從48 h開始，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S組降低最明顯，與C組及NC組對比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡

3組轉(zhuǎn)染CNEII細(xì)胞在未用放射線照射時(shí)， C組、NC組及S組的凋亡率分別為(7.3±1.7)%、(9.4±1.5)%、(18.4±2.6)%。S組凋亡率高于與NC組和C組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放射線照射后，C組、NC組、S組的凋亡率分別為(20.3±3.3)%、(19.4±4.5)%、(75.3±4.1)%；S組高于NC組和C組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖2　3組CNEII細(xì)胞轉(zhuǎn)染后MTT法測定生長曲線Fig.2　Growth curves of CNEII cells detected by MTT in three groups

3討論

正常組織的內(nèi)部平衡需要嚴(yán)格準(zhǔn)確的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖二者之間的平衡，為了達(dá)到這樣的平衡，一個(gè)龐大的基因網(wǎng)絡(luò)需要相互協(xié)作才能維持。腫瘤的形成大部分是由于異常的基因活躍后使細(xì)胞增殖超過細(xì)胞凋亡且賦予這些細(xì)胞不受控制的分化的能力[3]。作為凋亡抑制蛋白家族成員，Survivin在腫瘤的基因治療中一直備受關(guān)注。Survivin基因具有細(xì)胞周期性及腫瘤特異性，即在腫瘤細(xì)胞中特異性的表達(dá)，已有研究證實(shí)在臨床病例中，宮頸癌的病人病變組織中Survivin的含量顯著高于正常宮頸組織[4]。對44例施行放射線治療的子宮頸癌病人的組織切片的免疫組化分析顯示，組織切片中Survivin高表達(dá)的病人5年生存率更低[5]。提示Survivin基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。在胰腺癌細(xì)胞系中，Asanuma等[6]首次報(bào)道了Survivin mRNA的表達(dá)量與胰腺癌細(xì)胞對放射線治療的敏感性呈負(fù)相關(guān)，另外，施之不致細(xì)胞致死的放射線劑量照射后，細(xì)胞中Survivin的表達(dá)增加，這些結(jié)果為Survivin與放射治療敏感性之間的研究奠定了基礎(chǔ)。這也與本研究設(shè)計(jì)的初衷一致，一方面著眼于沉默Survivin對鼻咽癌細(xì)胞的凋亡增殖影響，另一方面更著重于觀察沉默Survivin后的鼻咽癌細(xì)胞對放射線的敏感性是否有變化。Survivin的抗凋亡機(jī)制主要是通過直接或間接抑制Caspase活性而發(fā)揮抗凋亡作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中在分子水平即將Survivin mRNA水平敲低，蛋白水平再次驗(yàn)證其敲除效果，以期從根本降低Survivin蛋白的表達(dá)，觀察后發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖被抑制，凋亡增加，肯定了Survivin作為抗癌靶點(diǎn)的突出效用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人的Survivin基因啟動(dòng)子之中含3個(gè)細(xì)胞周期依賴性因子(cellcycle-dependent，CED)和1個(gè)細(xì)胞周期同源性區(qū)域(cellcyclehomologyregion，CHR)，CDE和CHR是特異性存在于G2/M期的表達(dá)基因。所以，Survivin的表達(dá)有明顯的細(xì)胞周期性，即在細(xì)胞周期的G2/M期選擇性的表達(dá)[8]。缺氧和放射線能夠引起腫瘤細(xì)胞的G2/M期阻滯，由此可能造成放射線照射后細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)量增高，腫瘤細(xì)胞凋亡減少，從而造成瘤體對放射線的敏感性下降。在結(jié)腸癌的研究中，結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480(對放射治療低敏感性)及SW48(對放射線治療高敏感性)的兩株細(xì)胞比較，Survivin在SW480細(xì)胞系中高表達(dá)且用放射線照射該細(xì)胞后Survivin反應(yīng)性上調(diào)，而在SW48中Survivin低表達(dá)且用放射線照射后Survivin并沒有反應(yīng)性上調(diào)[9]。另有研究報(bào)道，進(jìn)行單獨(dú)放療的4例病人及放化療一體的14例病人的原代鼻咽癌細(xì)胞中，NF-κB和Survivin的高表達(dá)和腫瘤細(xì)胞凋亡減少相關(guān)，在使用RNAi抑制Survivin的表達(dá)后再輔以6Gy的放射線照射治療，腫瘤細(xì)胞的凋亡明顯增加[10]。本實(shí)驗(yàn)中光鏡下可觀察到細(xì)胞接受放射線照射后明顯膨脹，部分死亡，大部分細(xì)胞不能維持完整性，在流式細(xì)胞檢測圖上亦可證實(shí)。在施以放射線照射后，S組凋亡率較放射線照射前明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果與所報(bào)道相一致，也為Survivin作為臨床使用增加放療敏感的靶點(diǎn)基因增加了體外實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

注：A為放射線照射前，B為放射線照射后，橫坐標(biāo)為FITC通道綠色熒光值，縱坐標(biāo)為PI通道紅色熒光值圖3　轉(zhuǎn)染并經(jīng)放射線照射前后3組CNEII細(xì)胞的凋亡率Fig.3　Apoptosis rate of CNEII cells in three groups after exposure to radiation

本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染載體采用低毒性、無免疫原性的納米顆粒，較之病毒載體及傳統(tǒng)Lipofectamine在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中有更好的適應(yīng)性[11]，已在前期實(shí)驗(yàn)中成功證實(shí)其轉(zhuǎn)染可行性，加之本次研究結(jié)果，為提高鼻咽癌CNEII細(xì)胞對放射線敏感性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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(2016-01-15收稿，2016-04-06修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 周凌

Effects of Silencing Survivin Gene via Nanoparticles Technique on Proliferation and Apoptosis and Radiosensitivity of Nasopharyngeal Carcinoma Cell

DENG Wen1， SUN Maogang1， ZHAO Yan2， ZHAO houyu3

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofOtorhinolaryngology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effects of Silencing Survivin gene via nanoparticles technique on proliferation, apoptosis and radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells (CNEII). Methods: PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles were prepared. miRNA-Survivin plasmid was coated with PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles. CNEII cells were divided into blank control group (without plasmid, group C), nanoparticle interfering plasmid group (group S) and miRNA-NC plasmid control group (group NC). Fluorescence microscope was used to measure efficiency of transfection after 48 hours. Survivin protein was detected by Western blot and mRNAs were detected by RT-PCR. Cell proliferation was detected by MTT 24, 48, 72, 96 h after transfection; all groups were exposed to X ray after transfection at 48 h and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. Results: The transfection rate of miRNA-Survivin plasmid coated with PEI-Fe3O4 nanoparticles into CNEII cells was (60.9±3.9)%. The suppression ratio of Survivin protein and mRNA was 82.5% and 96.5% respectively in group S, which was lower than that of group C and group NC, indicating that PEI-Fe3O4 was successfully constructed. MTT showed that absorbance value of group S was lower than that in group C and group NC, which indicating that the proliferation of CNEII was inhibited. The ratio of cell apoptosis of group S exposed to 6 Gy was higher. The difference of Group S with Group NC and Group C was significant (P<0.05). Conclusion: Proliferation of transfected cells is inhibited while apoptosis rate is increased and even more obvious when exposed to radiation.

[Key words]nasopharyngeal carcinoma; Survivin gene；cell proliferation；apoptosis；radiosensitivity

[中圖分類號]R34-33; R739.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0377-05

*基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(NO.81260353)

**通信作者 E-mail:zhaohouyujia@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1751.006.html