青海上北山林場野生桃兒七根部內(nèi)生真菌群落組成及多樣性研究

寧祎　李艷玲　周國英　楊路存　徐文華

[摘要]該研究通過應(yīng)用第二代測序技術(shù)（NGS），即高通量測序方法測序青海野生桃兒七根內(nèi)真菌宏基因組ITS 1區(qū)，并依據(jù)RDP中設(shè)置的分類閾值對處理后的序列進(jìn)行物種分類，鑒定內(nèi)生真菌的群落組成。研究結(jié)果顯示，測序結(jié)果經(jīng)過質(zhì)量控制共獲得有效條帶22 565條，依據(jù)97%的序列相似性做聚類相似性分析，獲得全部樣品的可分類操作單元（OTUs）共517個，RDP分類依據(jù)08的分類閾值鑒定出的全部真菌可歸類為13綱、35目、44科、55屬。3個樣品LD1，LD2，LD3中共同的優(yōu)勢屬真菌為Tetracladium屬（所占比例分別為3549%，6855%，1296%），樣品的香濃多樣性指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)分別在175～292，011～032。研究結(jié)果表明，青海上北山林場野生桃兒七根內(nèi)內(nèi)生真菌具有較高的多樣性和較復(fù)雜的群落組成，蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生真菌資源，且高通量測序技術(shù)對于研究植物內(nèi)生真菌群落組成及多樣性具有顯著的優(yōu)勢。

[關(guān)鍵詞]桃兒七；內(nèi)生真菌；高通量測序；群落組成；多樣性

[Abstract]High throughput sequencing technology is also called Next Generation Sequencing （NGS）， which can sequence hundreds and thousands sequences in different samples at the same time In the present study， the cultureindependent high throughput sequencing technology was applied to sequence the fungi metagenomic DNA of the fungal internal transcribed spacer 1（ITS 1） in the root of Sinopodophyllum hexandrum Sequencing data suggested that after the quality control， 22 565 reads were remained Cluster similarity analysis was done based on 97% sequence similarity， which obtained 517 OTUs for the three samples （LD1， LD2 and LD3） All the fungi which identified from all the reads of OTUs based on 08 classification thresholds using the software of RDP classifier were classified as 13 classes， 35 orders， 44 family， 55 genera Among these genera，the genus of Tetracladium was the dominant genera in all samples（3549%， 6855% and 1296%）The Shannon′s diversity indices and the Simpson indices of the endophytic fungi in the samples ranged from 175～292， 011～032， respectivelyThis is the first time for applying high through put sequencing technologyto analyze the community composition and diversity of endophytic fungi in the medicinal plant， and the results showed that there were hyper diver sity and high community composition complexity of endophytic fungi in the root of ShexandrumIt is also proved that the high through put sequencing technology has great advantage for analyzing ecommunity composition and diversity of endophtye in the plant

[Key words]Sinopodophyllum hexandrum； endophytic fungi； high throughput sequencing； community composition； diversity

doi：10.4268/cjcmm20160712

桃兒七Sinopodophyllum hexandrum又名鬼臼、小葉蓮等，屬小檗科Berberidaceae桃兒七屬Sinopodophyllum多年生草本植物，我國珍稀瀕危物種，屬國家三級保護(hù)植物。桃兒七分布在海拔2 700～4 300 m的林下或灌叢中，在我國主產(chǎn)于青海、甘肅、四川西部、西藏、云南西北部、陜西等地，此外尼泊爾、不丹、印度北部、巴基斯坦、阿富汗東部和印控克什米爾等地也有分布[1]。桃兒七作為中國傳統(tǒng)中藥具有悠久的用藥歷史。藏醫(yī)以桃兒七果實入藥，可調(diào)經(jīng)活血、保胎、消腫、止痛。中醫(yī)以其根及根狀莖入藥，具有祛痰止咳，抗腫瘤，抗免疫等作用[2]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對其深入研究發(fā)現(xiàn)，桃兒七根莖內(nèi)含有較高的抗腫瘤活性物質(zhì)——木脂素類化合物，如鬼臼毒素、4′去甲基鬼臼毒素等。植物中獲取天然活性化合物治療人類疾病，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)史上占據(jù)著重要的地位，但隨著現(xiàn)代社會的高速發(fā)展，帶來的一系列問題導(dǎo)致某些包括野生植物資源在內(nèi)的自然資源日益枯竭。因此，許多的科研工作者將生產(chǎn)天然活性化合物的視角轉(zhuǎn)向了微生物方向，桃兒七內(nèi)生真菌即為當(dāng)今的研究熱點之一。

內(nèi)生真菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖在宿主植物體內(nèi)，而不引起植物發(fā)生明顯病變的一類真菌總稱[3]。目前認(rèn)為，地球上生存的所有高等植物都有內(nèi)生真菌的定殖，純培養(yǎng)研究結(jié)果顯示，定殖的內(nèi)生真菌種類少則十幾種多則上百種。內(nèi)生真菌與宿主植物之間的相互作用也多種多樣，如抗逆促生、抗蟲害、抗病害、環(huán)境修復(fù)及產(chǎn)活性產(chǎn)物等等[4]，因此研究宿主植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌群落組成和多樣性對研究內(nèi)生真菌與宿主間的相互作用具有重要的生態(tài)學(xué)意義。

高通量測序技術(shù)（HTS）起始于2005年，又被稱為第二代測序技術(shù)[5]，此技術(shù)能夠一次并行對幾百萬到上千萬條的DNA序列分別進(jìn)行測序，對于研究環(huán)境樣品中微生物群落組成具有巨大的應(yīng)用價值。目前高通量測序技術(shù)在水環(huán)境及土壤微生物群落研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。但此技術(shù)應(yīng)用在植物內(nèi)生真菌群落組成中的研究卻少有報道[68]，尤其在民族藥用植物宿主內(nèi)的內(nèi)生真菌群落組成的研究中尚未見報道。目前對于桃兒七植株內(nèi)生真菌群落組成的研究僅局限于純培養(yǎng)模式開展，取得了一些現(xiàn)有的結(jié)論[911]，但此方法具有一定的局限性，據(jù)統(tǒng)計利用培養(yǎng)基分離的內(nèi)生真菌種類總數(shù)不超過全部真菌總數(shù)的1%，甚至更低，因此利用純培養(yǎng)模式研究宿主植物內(nèi)生真菌的群落組成，其結(jié)果將會低估不能培養(yǎng)分離的內(nèi)生真菌對宿主植物的貢獻(xiàn)[12]。本文通過第二代測序技術(shù)——高通量測序?qū)μ覂浩吒鶅?nèi)內(nèi)生真菌的群落組成及多樣性進(jìn)行了研究，主要的目的有以下3個方面：①運用高通量測序技術(shù)掌握青海上北山林場桃兒七內(nèi)生真菌的群落組成及多樣性；②比較免培養(yǎng)測序結(jié)果與前人研究的純培養(yǎng)分離結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)差異；③探討桃兒七優(yōu)勢種內(nèi)生真菌的生態(tài)學(xué)功能?；谝陨涎芯磕康模谠S發(fā)現(xiàn)青海野生桃兒七宿主內(nèi)新的有價值真菌資源，為抗腫瘤藥物的獲取開辟一條新途徑，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11采樣

于2014年9月初，樣品采挖自青海省樂都區(qū)境內(nèi)的引勝溝上北山林場（102°23′540′′，36°42′172′′），海拔2 835 m。采樣時選取成年健康植株3株，根據(jù)隨機(jī)取樣原則，取樣的株距在30～50 m。樣品采挖后連帶根際土一并裝入干凈塑料袋，置入便攜式保溫箱中，編號標(biāo)記后帶回實驗室備用。

12樣品預(yù)處理

新鮮樣品采回后，洗凈桃兒七根部表面泥土，自來水下沖洗30 min，取出樣品置于無菌燒杯中用大量無菌水漂洗，待樣品干燥后置于無菌操作臺中。無菌操作臺中的樣品表面滅菌處理操作參照純培養(yǎng)模式下[13]的滅菌過程，具體方法如下：將樣品浸入70%乙醇1 min，再浸入5%的次氯酸鈉5 min，無菌水漂洗3次，待樣品干燥后剪切成小段置于無菌2 mL離心管中保存在冰盒中送樣。樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

13DNA提取及引物篩選

樣品中真菌總DNA的提取采用OMEGA公司生產(chǎn)的真菌提取試劑盒，依據(jù)生產(chǎn)商的說明提取。提取的DNA用Qubit 20 DNA檢測試劑盒檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。實驗選取3對真菌特異性引物2F/2R[14]，3F/3R[15]，ITS1/ITS2[16]，分別對應(yīng)擴(kuò)增ITS區(qū)域的58S，ITS2，ITS1區(qū)。隨機(jī)挑選一個樣品LD1進(jìn)行擴(kuò)增，每對引物設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)，篩選出最佳引物。

14高通量平臺測序

PCR擴(kuò)增引物為真菌特異性引物擴(kuò)增真菌的ITS1區(qū)，擴(kuò)增時引物融合測序平臺的通用標(biāo)簽序列以區(qū)分樣品，引物序列為：前置引物5′CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA3′，后置引5′GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC3′。其中，斜體序列為特異性引物序列，其他序列為添加的測序標(biāo)簽序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Illumina Miseq 2×300測序平臺進(jìn)行雙端測序分析。

15數(shù)據(jù)處理

151序列質(zhì)量控制對測序所得的序列進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)量控制包括3個部分，首先根據(jù)標(biāo)簽序列區(qū)分樣本后，將樣本中所得的標(biāo)簽序列去掉；其次，去除較短的片段序列，短片段的定義為小于50 bp；最后，應(yīng)用Prinseq軟件去除低復(fù)雜度的序列。最終得到的各樣本序列長度均在200 bp以上。

152OTU聚類及RDP分類根據(jù)質(zhì)量控制所得的優(yōu)質(zhì)序列，將多條序列按其序列間的距離根據(jù)聚類軟件Uclus對它們進(jìn)行聚類，序列間的距離相似性閾值設(shè)置為097，聚類為不同的操作分類單元（OTUs）。隨后應(yīng)用RDP classifier軟件基于Nave Bayesian assignment算法，對OTU聚類結(jié)果中的全部序列計算每條序列在屬水平上的RDP分類閾值，一般設(shè)置閾值為08歸類為一個屬，依此對各樣品中的菌群進(jìn)行分類。

153群落組成分析在形成的OTU聚類結(jié)果基礎(chǔ)上，對樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，通過計算樣本的豐富度指數(shù)、辛普森指數(shù)、香濃指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)來衡量樣本的物種多樣性。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，繪制樣品菌群分布條形圖，比較樣品間的菌群組成差異。

2結(jié)果

21引物篩選

3對引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1，1～4，5～8，9～12對應(yīng)的引物分別為2F/2R，3F/3R，ITS1/ITS2（每對引物設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)）。比對Marker可知，引物2F/2R擴(kuò)增出的條帶均大于600 bp，引物3F/3R擴(kuò)增出的條帶均小于200 bp，引物ITS1/ITS2擴(kuò)增出的條帶有2條分別對應(yīng)300，400 bp。根據(jù)Illumina Miseq 2×300測序平臺自身特點，引物2F/2R擴(kuò)增出的條帶過大，不能上機(jī)測序，引物3F/3R擴(kuò)增的條帶較短，測序結(jié)果可信度較差。引物ITS1/ITS2擴(kuò)增區(qū)域為ITS1區(qū)，條帶范圍在300～400 bp，符合Illumina Miseq 2×300測序平臺的測序條件。因此，確定ITS1/ITS2引物為本研究的最佳引物，具體見14。

22質(zhì)量控制

質(zhì)量控制前共獲得序列54 856條，質(zhì)量控制后共獲得優(yōu)質(zhì)序列22 565條，其中LD1，LD2，LD3分別為7 194，6 629，8 742條，全部序列長度均大于200 bp（=257 bp）。

23OTU聚類及RDP分類

質(zhì)控后獲得的序列，依據(jù)97%的序列相似性獲得的可分類操作單元（OTUs）517個。其中樣品LD1，LD2，LD3獲得的OTUs數(shù)目分別為305，253，138個。RDP分類全部OTUs可劃分為13綱，35目，44科，55屬。樣品LD1可劃分為10綱，20目，26科，31屬，LD2可被劃分為11綱，22目，25科，31屬，LD3可被劃分為9綱，17目，21科，27屬。

24物種分布

在門和屬2個層次上對3個樣品進(jìn)行群落組成分析。除去未鑒定出的真菌外，3個樣品均為子囊菌門和擔(dān)子菌門2個門，其中LD1，LD2樣品中子囊

菌門占絕對優(yōu)勢分別為7608%，7294%，樣品LD3中擔(dān)子菌門占絕對優(yōu)勢為8039%。在屬水平上進(jìn)行分析，除去未鑒定出的真菌群落，所示樣品中，見圖2。排名前3的優(yōu)勢屬真菌（所占比例之和超過全部的60%）LD1為Tetracladium，Hymenoscyphus，Pseudogymnoascus（ 3549%，1945%，1433%），樣品LD2中優(yōu)勢屬真菌為Tetracladium，unclassified_Sebacinaceae，Aspergillus（6855%，195%，122%），樣品LD3中優(yōu)勢屬真菌為unclassified_Sebacinaceae，Tetracladium，Pseudogymnoascus（8014%，1296%，273%）。3個樣品LD1，LD2，LD3中共同的優(yōu)勢屬真菌為Tetracladium屬，所占比例分別為3549%，6855%，1296%（=3647%）。

25α多樣性

3個樣品Alpha多樣性分析指數(shù)見表2。樣品的香濃多樣性指數(shù)在175～292，辛普森指數(shù)在011～032。其中樣品LD3的辛普森指數(shù)高于樣品LD1，LD2，樣品LD1，LD2的香濃多樣性指數(shù)高于樣品LD3，各樣品測序文庫的覆蓋率均達(dá)到98%以上。

3討論

31青海野生桃兒七內(nèi)生真菌群落組成及多樣性

目前，高通量測序技術(shù)研究宿主植物和環(huán)境中內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性趨勢，呈現(xiàn)逐漸上升的勢頭[6]。本研究OTUs聚類多樣性研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果類似[68]，例如通過454測序儀高通量測序研究夏威夷地區(qū)的鐵心木葉內(nèi)內(nèi)生真菌，不同生長環(huán)境類型下的大果礫葉內(nèi)內(nèi)生真菌及美國西海岸不同品系和生長類型的杜鵑屬葉內(nèi)內(nèi)生真菌，結(jié)果顯示，分別獲得OTUs單元4 253，689，488個。本研究通過應(yīng)用Illumina Miseq 2×300測序平臺共發(fā)現(xiàn)OTUs 單元517個，表明青海上北山林場的野生桃兒七根內(nèi)具有較高的真菌OTU豐度。

一般認(rèn)為不同氣候區(qū)域內(nèi)的宿主植物內(nèi)生真菌群落多樣性存在差異。如Arnold A E等[16]認(rèn)為熱帶地區(qū)的宿主植物內(nèi)生真菌的豐富度及系統(tǒng)發(fā)育多樣性均高于溫帶和寒帶地區(qū)。但Zimmerman N B等[6]對夏威夷處于不同海拔高度（100～2 400 m）同一宿主植物鐵心木內(nèi)生真菌454測序研究，結(jié)果表明低海拔地區(qū)與高海拔地區(qū)的內(nèi)生真菌多樣性并沒有顯著差異。李海燕等[17]通過對云南白馬雪山5種優(yōu)勢種植物內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，得出內(nèi)生真菌的香濃多樣性指數(shù)在125～270，表明在高海拔嚴(yán)寒地區(qū)植物內(nèi)生真菌同樣具有較高的多樣性分布。青海上北山林場位于青藏高原東北部，屬于高海拔、高輻射、年均溫較低的高寒地區(qū)。研究結(jié)果顯示，桃兒七根內(nèi)內(nèi)生真菌的香濃指數(shù)在175～292，與上述研究結(jié)果相類似，表明位于高海拔高寒地區(qū)的桃兒七植物內(nèi)同樣含有較高的內(nèi)生真菌多樣性豐度。有研究表明，傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法分離出的真菌類群低估了內(nèi)生真菌群落的多樣性[12]。本研究通過免培養(yǎng)高通量測序技術(shù)手段共獲得OTUs 單元517個，全部真菌可歸類為13綱、35目、44科、55屬。前人通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)基分離方法對桃兒七內(nèi)生真菌的群落組成進(jìn)行研究，取得了一定的結(jié)果，但分離到的真菌群落多樣性普遍較低，如畢江濤等[9]對寧夏涇源縣境內(nèi)的野生桃兒七內(nèi)生真菌純培養(yǎng)分離，共得到可培養(yǎng)真菌49株，歸屬于2目、3科、9屬。張琨等[10]對陜西太白山境內(nèi)的野生桃兒七內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)，獲得內(nèi)生真菌26株歸屬于2目、3屬。李海燕等[11]對云南中甸地區(qū)的野生桃兒七內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)，獲得菌株28株可歸屬為5目、6科、9屬。據(jù)目前所知，全部區(qū)域隸屬于青藏高原的青海地區(qū)野生桃兒七內(nèi)生真菌純培養(yǎng)分離研究雖然未見相關(guān)報道，但本研究應(yīng)用免培養(yǎng)高通量測序技術(shù)手段所得結(jié)果與前人純培養(yǎng)分離其他地域的桃兒七內(nèi)生真菌結(jié)果相比，免培養(yǎng)高通量測序技術(shù)得出的內(nèi)生真菌類群無論種屬和數(shù)量均遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)研究模式。這表明應(yīng)用純培養(yǎng)分離模式研究植物內(nèi)生真菌的群落組成確實具有一定的局限性，桃兒七根內(nèi)蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生真菌資源可供開發(fā)利用，免培養(yǎng)高通量測序手段對于研究植物內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)組成具有顯著的優(yōu)勢。

32優(yōu)勢屬內(nèi)生真菌生態(tài)學(xué)功能探討

在屬水平上，所有的真菌類群可以被分成4大類：3個樣品中均出現(xiàn)、只在2個樣品中出現(xiàn)、只出現(xiàn)在1個樣品中及未鑒定出的類群。由表1可知，3個樣品中所有真菌可被劃分為55個類群。其中3個樣品中均出現(xiàn)的有8個屬，豐度為457%，只在兩個樣品中出現(xiàn)的有14個屬，豐度為306%，只出現(xiàn)在一個樣品中的有31個屬，豐度為70%（其中Hymenoscyphus屬真菌只出現(xiàn)在樣品LD1中，單個樣品中豐度1945%，占總體豐度645%，另外30個屬，總體豐度為055%），未鑒別出的有2個屬，豐度為167%。研究結(jié)果顯示，在所有樣品中均出現(xiàn)的8個屬真菌類群卻貢獻(xiàn)了樣品中接近一半的豐度值（457%）。前人研究表明，宿主植物能夠顯著影響內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)[1819]。宿主植物通過組織內(nèi)的微環(huán)境與內(nèi)生真菌發(fā)生相互作用，其能夠通過分泌合成一些代謝產(chǎn)物來間接調(diào)控內(nèi)生真菌的群落組成。同樣，內(nèi)生真菌群落中各真菌共處于同一生態(tài)位空間中，其相互競爭也是導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的內(nèi)在因素[20]。本研究結(jié)果顯示，8個優(yōu)勢屬真菌占據(jù)群落中將近一半的豐度值，這種群落結(jié)構(gòu)組成必然是真菌群落與宿主植物相互作用及菌群間相互競爭的結(jié)果，豐度值較大的優(yōu)勢種真菌可能在與宿主植物相互作用中扮演者重要的角色。只存在于一個樣品中的30個稀有種真菌（055%）可能是偶然定殖到宿主植物體內(nèi)的伴生種，它們的定殖可能具有一定的隨機(jī)性。

本研究3個樣品中共同的優(yōu)勢屬真菌為Tetracladium。Tetracladium屬真菌的記錄多以水生絲孢菌居多[2122]，大多來源分離自水中的凋落葉及泡沫中，具有分解凋落物的功能[23]。也有一些學(xué)者從不同的宿主植物根部純培養(yǎng)分離到Tetracladium屬的內(nèi)生真菌類群[2326]。如Nemec等[24]首次從草莓屬的根部分離到一株Tetracladium屬內(nèi)生真菌T marchalianum。Watanabe T等[25]也從龍膽屬植物和草莓屬植物的根部分離到Tetracldium屬的內(nèi)生真菌新種T setigerum。此后，Sati S C等[23，26]陸續(xù)從不同的宿主植物根部分離到Tetracladium屬的內(nèi)生真菌。本研究通過高通量測序首次在桃兒七根部檢測到Tetracladium屬內(nèi)生真菌，并且是作為優(yōu)勢屬類群存在。目前關(guān)于此類內(nèi)生真菌定殖在宿主植物內(nèi)發(fā)揮的生態(tài)學(xué)功能尚不清楚。桃兒七生境喜陰，多分布在溪邊溝渠的林下或稀疏灌木中，林下枯枝凋落物豐富，土壤水分含量大。有學(xué)者認(rèn)為植物根部可能充當(dāng)一個Tetracladium屬真菌季節(jié)性周轉(zhuǎn)的容器，當(dāng)葉等凋落物不宜被分解利用時發(fā)揮降解功能[27]。本研究的采樣時間為9月初，此時采樣地包括桃兒七在內(nèi)的各植物物種均處于生長末期，枝葉即將枯落。因此桃兒七根部可能季節(jié)性存儲了此類具有降解功能的內(nèi)生真菌類群，土壤微生物分解凋落物不力時，菌體進(jìn)入環(huán)境分解腐殖質(zhì)供次年生長循環(huán)利用，關(guān)于此點推論若條件允許將對桃兒七根內(nèi)菌群的季節(jié)動態(tài)加以研究驗證。

此外，研究中還發(fā)現(xiàn)了一些常見的內(nèi)生真菌類群。如青霉屬、木霉屬、曲霉屬等均為常見的內(nèi)生真菌類群，曾被報道為不同環(huán)境群落中的優(yōu)勢屬內(nèi)生真菌[17]。油瓶霉屬、外瓶霉屬、短梗霉屬、肉座菌屬、Cadophora sp真菌以及一些糞殼菌目、柔膜菌目、炭角菌目、錘舌菌綱、座囊菌綱的真菌也作為不同地區(qū)不同宿主的內(nèi)生真菌被廣泛報道[20，2833]。研究中還發(fā)現(xiàn)一些可能是作為植物病原菌的一些真菌類群如白粉菌屬和高氏白粉菌屬等，這些類群真菌可能為桃兒七的病原性真菌被檢測出來。值得注意的是，截盤多毛孢屬真菌在應(yīng)用純培養(yǎng)分離時也被分離培養(yǎng)出來，對其初步的研究表明，其能夠合成宿主桃兒七根部提取物抗腫瘤藥物鬼臼毒素類化合物。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]