HPLC睧LSD同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)中3種三萜皂苷的含量

吳培云　任亞碩　吳德玲　喬金為

[摘要]建立了HPLCELSD測(cè)定醉魚草果實(shí)中三萜類成分含量的方法。采集不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)藥材共9批，采用反相高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定其三萜成分。色譜條件：Waters SunFireTM C18柱（46 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇水（82∶18）溶液，體積流量1 mL·min-1，柱溫30 ℃。ELSD參數(shù)：漂移管溫度106 ℃，噴霧溫度50 ℃，載氣（N2）流速15 L·min-1，增益系數(shù)1。結(jié)果表明醉魚草果實(shí)中的3種三萜成分clinoposaponin Ⅲ， desrhamnoverbascosaponin， mimengoside Ⅰ的進(jìn)樣量分別在0702～2808 μg（r=0999 2），0390～1560 μg（r=0998 9），0192～768 μg（r=0999 0）呈良好線性關(guān)系；平均加樣回收率（n=6）分別為9941%，9908%，9867%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為086%，16%，18%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，適用于測(cè)定醉魚草果實(shí)中三萜類成分的含量。

[關(guān)鍵詞]醉魚草；三萜；HPLCELSD；含量測(cè)定

[Abstract]To establish an HPLCELSD method for the quantification of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana The RPHPLCELSD method was used for the determination of triterpenoids in B lindleyana fruits， which were collected from different habitats The column used was a packed with 5 μm stationary phase Waters SunFireTM C18（46 mm×150 mm， 5 μm） The mobile phase consisted of Methanolwater（82∶18） at a flow rate of 1 mL·min-1 Column temperature： 30 ℃ ELSD conditions： drift tube temperature： 106 ℃； carrier gas （nitrogen） flow rate： 15 L·min-1； amplification factor： 1 The calibration curves showed good linear relationship on a range from 0702 to 2808 μg（r=0999 2） for Clinoposaponin III， 0390 to 1560 μg（r=0998 9） for Desrhamnoverbascosaponin and 0192 to 768μg（r=0999 0） for Mimengoside I The average recovery rate（n=6） were 9941%， 9908% and 9867% and it′s RSD were 086%， 156% and 180% This method can be used to determine the contents of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana for its simplicity， accurateness and reliability

[Key words]Buddleja lindleyana； triterpenoids； HPLCELSD； determination of content

doi：10.4268/cjcmm20160710

醉魚草果實(shí)藥材為馬錢科Loganiaceae植物醉魚草Buddleja lindleyana Fortune的果實(shí)，具有祛風(fēng)除濕、止咳化痰、散瘀之功效[1]。課題組通過對(duì)醉魚草果實(shí)的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，醉魚草果實(shí)分離所得的單體化合物中，三萜及其苷類占絕大多數(shù)，且具有一定的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性[24]。為了加強(qiáng)對(duì)醉魚草資源的綜合開發(fā)利用，本文對(duì)采集自萬佛山、天柱山、歙縣3個(gè)不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)中齊墩果烷型三萜皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定。

三萜類成分的含量測(cè)定一般采用香草醛冰醋酸、高氯酸顯色法，本課題組前期已建立了紫外分光光度法測(cè)定醉魚草果實(shí)中總?cè)坪康姆椒╗5]，雖可為醉魚草果實(shí)中三萜含量的測(cè)定提供參考，但該方法準(zhǔn)確度不高，專屬性較差，有一定的局限性，考慮到醉魚草果實(shí)中的三萜成分紫外吸收不強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)選用通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）。本文首次報(bào)道了HPLCELSD[67]測(cè)定醉魚草果實(shí)中三萜成分的含量，并對(duì)不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)藥材進(jìn)行分析，以期為醉魚草的質(zhì)量研究提供參考。

1材料

11儀器美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀（二元泵 G1312C，柱溫箱 G1316A；自動(dòng)進(jìn)樣器 G1329B，檢測(cè)器 380ELSD）；分析天平（瑞士METTLER TOLEDO AB135S）；高速中藥粉碎機(jī)（浙江省溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠 FZ02型）；超聲清洗儀（天津奧特塞恩斯 AS3120）；一體式超純水系統(tǒng)（德國(guó)默克密理博MilliQ）。

12試藥clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengoside Ⅰ的對(duì)照品均從醉魚草果實(shí)提取物中分離得到，并由現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，見圖1。用歸一化法測(cè)得3種對(duì)照品純度均大于98%；甲醇為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，其余試劑均為分析純。醉魚草果實(shí)藥材分別采自安徽舒城萬佛山（2012年11月）、潛山天柱山（2013年9月）以及歙縣（2013年11月）地區(qū)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為馬錢科植物醉魚草B lindleyana的果實(shí)。

2方法及結(jié)果

21對(duì)照品溶液的制備精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的化合物clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengoside Ⅰ對(duì)照品2633，1462，721 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，得質(zhì)量濃度為1053，0585，0288 g·L-1的對(duì)照品溶液，然后將此3個(gè)對(duì)照品溶液按1∶1∶1混合，即得質(zhì)量濃度分別為0351，0195，0096 g·L-1的混合對(duì)照品溶液。

22供試品溶液的制備精密稱取不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)粗粉2 g，置50 mL圓底燒瓶中，加80%乙醇20 mL回流提取3次，每次1 h，合并濾液，轉(zhuǎn)移置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得供試品溶液。

23色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件：Waters SunFireTM C18柱（46 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇水（82∶18）溶液，體積流量1 mL·min-1，柱溫30 ℃。ELSD參數(shù)：漂移管溫度106 ℃，噴霧溫度50 ℃，載氣（N2）流速15 L·min-1，增益系數(shù)1。在色譜條件下，取供試品溶液、對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣20 μL，3種成分均能與其他組分達(dá)到基線分離，對(duì)照品溶液及供試品溶液的HPLC色譜圖見圖2。

24線性關(guān)系考察對(duì)照品溶液采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量依次為2， 5， 10， 20， 40， 60， 80 μL，按照23項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積值的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程見表1。

25精密度試驗(yàn)對(duì)照品溶液采用自動(dòng)進(jìn)樣器精密吸取20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。得出clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ對(duì)應(yīng)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation， RSD）分別為088%，096%，16%，說明儀器精密度良好。

26重復(fù)性試驗(yàn)按22項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的色譜峰面積，計(jì)算平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2152%，0806%，0194%，RSD（n=6）分別為12%，10%，20%。表示該方法測(cè)定這3種三萜含量的重復(fù)性良好。

27穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12 h自動(dòng)進(jìn)樣20 μL，測(cè)定clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的對(duì)應(yīng)色譜峰面積，計(jì)算RSD（n=5）分別為12%，084%，14%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

28加樣回收率試驗(yàn)精密稱取萬佛山產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)粗粉9份（3種三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2152%，0806%，0194%），每份10 g，分別向其中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液（分別相當(dāng)于藥材原有含量的50%，100%，150%），每一質(zhì)量濃度取3份，按22項(xiàng)方法制備供試品溶液，得6份加標(biāo)溶液。采用自動(dòng)進(jìn)樣器分別精密進(jìn)樣20 μL，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果得clinoposaponin Ⅲ的加樣回收率為9941%，RSD 086%；desrhamnoverbascosaponin的加樣回收率為9908%，RSD為16%；mimengosideⅠ的加樣回收率為9867%，RSD 18%，結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)證明，加樣回收率良好。

29樣品含量測(cè)定取不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)（萬佛山、天柱山、歙縣），按22方法進(jìn)行操作，分別制成供試品溶液，同一批次平行測(cè)定2份。在23色譜條件下各進(jìn)樣20 μL，測(cè)定不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)中clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的平均含量（n=3），結(jié)果見表3。

從試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出，不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)中三萜成分的含量存在差異，以天柱山產(chǎn)地的clinoposaponin Ⅲ含量較高，而萬佛山產(chǎn)地的desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ含量較高。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLCELSD法測(cè)定3種三萜皂苷的含量，可以在一定程度上反映出醉魚草果實(shí)中三萜類成分的總含量。

3討論

本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究基礎(chǔ)上，參考正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出的最佳提取工藝[8]，最終選定80%乙醇，回流提取3次，每次1 h，料液比1∶10提取。

MimengosideⅠ附近的峰分離有一定難度，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇水系統(tǒng)80∶20，85∶15，82∶18，84∶16等多種流動(dòng)相的比例，最終選定甲醇水82∶18時(shí)分離度最好，峰形也較好，并能使檢測(cè)組分在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的分離。根據(jù)流動(dòng)相比例，分別在100，106，110 ℃的漂移管溫度下，考察載氣流速，最終確定ELSD檢測(cè)器最優(yōu)參數(shù)：漂移管溫度106 ℃，N2流速15 L·min-1。

本文選取從醉魚草果實(shí)中分得的3種齊墩果烷型三萜皂苷類化合物clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ作為指標(biāo)性成分，其中mimengosideⅠ為課題組首次報(bào)道的新化合物[3]，采用HPLCELSD測(cè)定其中三萜類成分，相比于課題組前期建立的紫外分光光度法[5]，準(zhǔn)確度更高、專屬性更強(qiáng)。HPLCELSD測(cè)得結(jié)果，在一定程度上能反應(yīng)醉魚草果實(shí)中三萜類成分的總含量，方法學(xué)試驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，表明該方法可行性較高。不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)中三萜成分的含量存在差異，這可能與產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境、藥材采收時(shí)間等因素有關(guān)，后續(xù)可開展有關(guān)醉魚草不同采收期化學(xué)成分研究的實(shí)驗(yàn)工作。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]