Cu（Ⅱ）希夫堿配合物與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用

唐潔

（桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與藥學(xué)系，廣西 桂林 541001）

Cu（Ⅱ）希夫堿配合物與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用

唐潔

（桂林師范高等?？茖W(xué)校化學(xué)與藥學(xué)系，廣西 桂林 541001）

以配體N’N’-2[(吡啶-2-基)苯亞甲基]1，2-環(huán)己二胺（H2L）為配體，合成了雙核Cu（Ⅱ）配合物Cu2L，并用紅外光譜（IR）、低分辨質(zhì)譜（MS）、元素分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。通過紫外可見吸收光譜法（UV）、圓二色光譜法（CD）探究金屬配合物和血清白蛋白（BSA）之間的作用方式。結(jié)果表明：配合物與BSA的結(jié)合引起了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；配合物與BSA之間的結(jié)合類型主要靠氫鍵和范德華力作用力結(jié)合。

希夫堿配合物；牛血清白蛋白；相互作用

血清白蛋白是最豐富的血漿蛋白，而90%以上的金屬藥物都能以共價(jià)鍵與血漿蛋白質(zhì)相結(jié)合。[1]因此血清白蛋白起著存放和運(yùn)輸一些藥物和許多其它生物活性小分子的作用。[2]當(dāng)血清白蛋白與較小的分子結(jié)合后，其構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變。[3]因此，研究藥物或小分子與血清白蛋白的相互作用在生物科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)倍受關(guān)注。[4]它有助于對(duì)作用機(jī)理和代謝過程的理解，并且為修飾藥物結(jié)構(gòu)和合成新的藥物提供了一定的指導(dǎo)。小分子配合物在生物和醫(yī)藥應(yīng)用，包括抗微生物、抗細(xì)菌、抗真菌、消炎和抗腫瘤活性均已被廣泛報(bào)道。[5]

本文首先合成了Cu希夫堿配合物。鑒于牛的血清白蛋白（BSA）和人血清蛋白（HSA）具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，我們選擇BSA作為靶蛋白，研究了在生理?xiàng)l件下金屬配合物與BSA的相互作用，通過紫外可見吸收光譜法（UV）、圓二色光譜法（CD）得出金屬配合物和血清白蛋白之間作用方式。從分子水平上了解和闡明金屬配合物分子與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，為金屬配合物與細(xì)胞的相互作用研究提供了參考依據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)部分

(一)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑和藥品均為分析純。牛血清白蛋白（BSA，分子量為66210，購自Sigma公司，上海）；緩沖溶液為0.05mol·L-1的磷酸緩沖溶液（PBS），PH=7.43，其中含0.1 mol·L-1NaCl；低分辨質(zhì)譜用LCQ/AD Quadrupole Ion Trap ESI-MS電噴霧質(zhì)譜（Thermo-Finngan）測(cè)定；元素分析經(jīng)PE2400II元素分析儀（PerkinElmer）測(cè)定；紅外光譜用PE Spectrum One FT-IR Spectrometer傅立葉變換紅外光譜儀（PerkinElmer）（KBr壓片）測(cè)定；紫外吸收光譜經(jīng)Cary-100紫外可見分光光度計(jì)（美國，Varian公司）測(cè)定；圓二色光譜用Jasco-810圓二色光譜儀（日本，Jasco公司）測(cè)定；超級(jí)恒溫水浴箱控溫箱（國華儀器廠）；可調(diào)試移液槍。

（二）配體（H2L）和配合物（CuL）的合成與表征

配體參照文獻(xiàn)[6]合成方法來合成，取L配體（0.3 mmol）和CuCl22H2O（0.3 mmol）放入容積為15毫升并帶有聚四氟乙烯襯底的水熱反應(yīng)釜中，加入15 mL無水乙醇后密封。加熱到80℃，并保持72小時(shí)。然后以每小時(shí)5℃的速度緩慢冷卻至40℃，可得到綠色塊狀晶體。將得到的晶體用無水乙醇洗滌后置于空氣中自然干燥，產(chǎn)率為44%。元素分析（C30H30Cl4Cu2N4）理論值：C，50.36；H，4.23；N，7.83。實(shí)驗(yàn)值：C，50.02；H，4.33；N，7.90。FT-IR（KBr phase,cm-1）：2934 (m)，2058(s)，1643(s)，1590(s)，1442(m)，1348(m)，1318(m)，1258 (w)，1105(m)，1008(m)，955(w)，804(m)，705(m)，632(w)。ESI-MS：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可初步推斷m/z 713.00為Cu2L的準(zhǔn)分子離子峰[Cu2L+H][＋]。

（三）圓二色光譜的測(cè)定

往1cm的石英比色皿中加入3.0mL濃度為1.0× 10-3mol·L－1BSA溶液，用可調(diào)試移液槍依次加入一定量的濃度為1.0×10－3mol·L－1的配合物溶液，使BSA與配合物溶液的物質(zhì)的量濃度比分別為1：0、1：1.5、1：3，掃描以上溶液體系的圓二色光譜，譜圖中已經(jīng)分別扣除了配合物溶液和PBS緩沖溶液的干擾。

（四）紫外可見吸收光譜的測(cè)定

往1cm的石英比色皿中加入3.0 mL，pH=7.43的磷酸緩沖溶液（PBS），用可調(diào)試移液槍分別往兩個(gè)比色皿中加入3μl的濃度均為1×10-3mol·L-1BSA溶液，后依次加入一定量濃度為1×10-3mol·L-1的配合物溶液，使配合物與BSA的濃度之比依次增大，每次加樣后均混合均勻，使之充分反應(yīng)。在室溫下，用Cary-100紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其200-400 nm范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜。譜圖中已扣除了緩沖溶液的干擾。

二、結(jié)果和討論

(一)BSA和配合物相互作用的圓二色光譜分析

圓二色（CD）光譜法是表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的最有效的手段之一，[7]其中，在遠(yuǎn)紫外區(qū)，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵的n→π*躍遷會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)特征吸收峰，在圓二色光譜中顯示為兩個(gè)負(fù)峰，即分別為208、222 nm處的兩個(gè)負(fù)峰,這兩個(gè)負(fù)峰與BSA分子的α–helix結(jié)構(gòu)存在著很大的關(guān)系，[8]并且它們的吸收峰的強(qiáng)度可以反映蛋白質(zhì)α–helix的含量。[9]圖1為配合物與BSA不同濃度比例下的圓二色光譜，圖中已扣除了緩沖液的影響。

圖1 BSA與配合物CuL相互作用的園二色光譜圖

(a)1.0×10-3mol·L－1BSA；(b)1.0×10－3mol·L－1BSA+1.5×10－3mol·L－1Cu2L；(c)1.0×10－3mol·L－1+ 3.0×10－3mol·L－1Cu2L；PH=7.43

從圖1中可以看出，配合物的加入并沒有引起蛋白質(zhì)峰形的發(fā)生變化，但是位于208 nm和222 nm處的兩個(gè)負(fù)峰的強(qiáng)度隨著配合物的濃度增加逐漸減小，這表明配合物與BSA的結(jié)合引起了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致BSA中α–helix結(jié)構(gòu)含量下降，但并未導(dǎo)致主體構(gòu)象的大變化，BSA分子中的主要構(gòu)象仍為α–helix結(jié)構(gòu)。[10]配合物與蛋白質(zhì)中肽鏈上的氨基酸殘基相結(jié)合，并破壞了它們之間形成的網(wǎng)狀氫鍵骨架。[13]

(二)紫外-可見光譜的測(cè)定

圖2 BSA與配合物相互作用的紫外可見吸收光譜圖

(a)1.0×10－3mol·L－1BSA+1.5×10－5mol·L－1Cu2L；(b)1.0×10－3mol·L－1BSA+3×10－5mol·L－1Cu2L；(c)1.0×10－3mol·L－1BSA+4.5×10－5mol·L－1Cu2L；[d]1.0×10－3 mol·L－1BSA+6.0×10－5mol·L－1Cu2L；PH=7.43.

紫外-可見吸收光譜也是研究配合物的形成及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的有效方法之一，通過紫外-可見吸收光譜可以推斷蛋白質(zhì)分子中生色基團(tuán)的環(huán)境變化。[11]血清白蛋白能產(chǎn)生紫外吸收光譜的主要原因是色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基對(duì)光的吸收。當(dāng)向血清白蛋白中加入藥物后，往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)生色團(tuán)紫外吸收光譜的變化，如吸收峰紅移或藍(lán)移、吸光度的變化。

單純的BSA有兩個(gè)特征吸收峰，即203 nm附近的肽鍵的特征吸收峰和279 nm附近的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基中的雜環(huán)共軛雙鍵的特征吸收峰。配合物與BSA相互作用的紫外-可見吸收光譜如圖2所示，隨著配合物的加入，兩個(gè)吸收峰的峰位和強(qiáng)度均有一定的改變，但是BSA紫外吸收峰的峰形基本不變，在208nm處的吸收峰峰位和強(qiáng)度變化相對(duì)比較明顯，即吸收峰的強(qiáng)度明顯降低，出現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)并且同時(shí)出現(xiàn)一定的紅移現(xiàn)象，而在278 nm處的吸收峰藍(lán)移至277 nm處，出現(xiàn)了增色效應(yīng)，強(qiáng)度增強(qiáng)。血清白蛋白在220 nm附近的吸收峰主要是由于血清白蛋白特征鍵肽鍵C=O的ππ*躍遷引起的，而在278 nm處的吸收峰是色氨酸殘基的特征吸收峰。這說明了血清白蛋白中的色氨酸殘基與配合物發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致了BSA中色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了改變，使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

三、結(jié)論

綜上所述，希夫堿配合物Cu2L能使血清白蛋白BSA的構(gòu)象發(fā)生改變，證實(shí)了小分子與血清白蛋白發(fā)生了相互作用。

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Interaction of Cu(II)Schiff Base Complexes with Bovine Serum Albumin(BSA)

Tang Jie
(Department of Chemistry and Pharmacy,Guilin Normal College,Guilin,Guangxi,541001,China)

A Cu(Ⅱ)complex(Cu2L)derived from Schiff base ligand(H2L=N’,N’-bis[(pyridine-2-yl)benzybenzylidene]ethane-1,2-diamine)was synthesized and characterized by IR,NMR,MS.The binding way of complex and bovine serum albumin(BSA)was investigated.The results showed that the combination with compound caused the change in the secondary structure of the protein.The binding types of complex and BSA were mainly based on hydrogen bond and Van der Waals'force.

schiff base complexes;bovine serum albumin;interaction

O62

A

1001-7070（2016）01-0131-03

（責(zé)任編輯：楊建香）

2015-12-01

唐潔（1981-），女，廣西桂林人，桂林師范高等?？茖W(xué)校講師，主要從事生物無機(jī)方面的研究。