雙缺陷型畢赤酵母X33突變株的誘變育種

顧鵬飛，　李　萌，　朱瑞宇，　金　堅（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122）

?

雙缺陷型畢赤酵母X33突變株的誘變育種

顧鵬飛1，2，李萌1，2，朱瑞宇1，2，金堅1，2
（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122）

摘要：為促進(jìn)Pichia pastoris X33 α-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶（OCH1p）與α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶（ALG3p）雙突變菌株（och1 alg3 mX33）作為蛋白質(zhì)表達(dá)宿主菌的應(yīng)用，為雙突變菌株進(jìn)一步糖基化的研究奠定基礎(chǔ)。作者通過紫外誘變和常壓室溫等離子體（ARTP）誘變的方法來提高雙突變菌株的生長速度以及適應(yīng)能力。經(jīng)過4輪篩選發(fā)現(xiàn)了生長速度提高15%、溫度敏感性有所降低、細(xì)胞存活率有所提高的雙突變菌株。

關(guān)鍵詞：糖基化；誘變；生長表型；甘露糖轉(zhuǎn)移酶

畢赤酵母作為生產(chǎn)重組蛋白藥物的宿主菌，已廣泛用于重組蛋白質(zhì)的表達(dá)[1-2]。但其對蛋白質(zhì)的過度糖基化修飾，可產(chǎn)生不同于哺乳動物細(xì)胞的高甘露糖型糖基[3]。酵母與哺乳動物細(xì)胞對糖蛋白的糖基化過程，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的起始過程相同，都會形成相同的核心糖鏈結(jié)構(gòu)Man8GlcNAc2，但在轉(zhuǎn)移至高爾基體進(jìn)行后續(xù)的糖基化時，酵母與哺乳動物細(xì)胞的糖基化過程存在明顯差異[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，在畢赤酵母高爾基體中，蛋白糖基在α-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶（OCH1p）和α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶（ALG3p）的作用下，繼續(xù)添加甘露糖，導(dǎo)致過度糖基化[6-7]。

作者所在課題組已成功獲得—OCH1（α-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶）基因和ALG3（α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶）基因雙敲除菌株，并利用突變菌株作為宿主工程菌對GM-CSF進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果顯示，Pichia pastoris X33雙突變菌株對外源蛋白質(zhì)的表達(dá)具有畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的大多優(yōu)點[8]。但是，雙突變菌株的生長速度與野生菌相比顯著降低，對于GM-CSF的表達(dá)水平與野生菌相比也明顯下降，極大地限制了突變菌作為宿主工程菌的應(yīng)用。因此，作者通過誘變育種的方法提高雙突變菌的生長速度和適應(yīng)能力[9-11]，以進(jìn)一步提高Pichia pastoris X33雙突變菌株作為宿主工程菌應(yīng)用的可行性，為雙突變菌株進(jìn)一步糖基化的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株P(guān)ichia pastoris X33野生型菌株：作者所在研究室保存；Pichia pastoris X33雙突變菌株：作者所在研究室構(gòu)建。

1.1.2試劑蛋白胨、酵母提取物、無氨基酸酵母氮源（YNB）：加拿大BIO BASIC INC公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。臺盼藍(lán)（Trypan blue）、山梨醇（Sorbitol）、阿利新蘭（Alcian blue）和剛果紅（Congo red）：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基及溶液的配制

1）YPD培養(yǎng)基：1 g/dL酵母提取物，2 g/dL蛋白胨，2 g/dL葡萄糖，固體培養(yǎng)基添加1.5 g/dL瓊脂粉。

2）YPD+sorbitol培養(yǎng)基：1 g/dL酵母提取物，2 g/dL蛋白胨，2 g/dL葡萄糖，0.4 mol/L sorbitol，固體培養(yǎng)基添加1.5 g/dL瓊脂粉，1 mol/L sorbitol。

3）PBS緩沖液（pH 7.3）：135 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.3 mmol/L Na2HPO4，1.4 mmol/L K2HPO4。

4）Tris緩沖液（pH 7. 5）：50 mmol/L Tris，用HCl調(diào)pH值至7. 5。

5）呂氏堿性美藍(lán)染色液：美藍(lán)0.3 g溶于30 mL 95%乙醇后與100 mL 0. 01%氫氧化鉀溶液混合。

1.2實驗方法

1.2.1誘變實驗方法

1）制作紫外誘變致死率標(biāo)準(zhǔn)曲線：從YPD平板上挑取P. pastoris X33雙突變菌株的單菌落，在YPD液體培養(yǎng)基中28℃、215 r/min培養(yǎng)48 h，將酵母菌懸液稀釋到1 000個/mL，分別在紫外燈下暴露10、20、30、40、50、60、70、80、90 s，期間用轉(zhuǎn)子攪拌。誘變后涂板，并避光培養(yǎng)3～7 d。長出菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)，制作致死率標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）雙突變菌的紫外誘變育種：紫外誘變40 s時死亡率達(dá)到90%，故將誘變時間設(shè)在40 s。將酵母菌懸液稀釋到1 000個/mL，打開紫外燈照射40 s，完后涂板，并避光培養(yǎng)3～7 d，每天查看菌落生長情況，尋找生長速度加快的菌株并保藏菌種。

3）制作ARTP等離子誘變致死率標(biāo)準(zhǔn)曲線：從YPD平板上挑取P. pastoris X33紫外誘變菌株的單菌落，在YPD液體培養(yǎng)基中28℃、215 r/min培養(yǎng)48 h，將酵母菌懸液調(diào)節(jié)OD至6～8，分別在等離子體下照射20、40、60、80、100 s。誘變完后涂板，培養(yǎng)5～7 d。長出菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)，制作致死率標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4）紫外誘變菌的ARTP誘變育種：誘變60 s時死亡率達(dá)到80%，故將誘變時間設(shè)在60 s。等離子態(tài)照射60 s，之后10倍系列稀釋涂板，培養(yǎng)3～7 d，每天查看菌落生長情況，尋找生長速度加快的菌株并保種。

1.2.2對誘變菌生長情況的研究方法

1）種子活化及生長曲線測定：從YPD平板上挑取P. pastoris X33雙突變菌株和P. pastoris X33誘變菌株的單菌落，在YPD液體培養(yǎng)基中28℃、215 r/min活化培養(yǎng)48 h。將活化的種子轉(zhuǎn)接至新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，分別取培養(yǎng)12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36、40、44、48、52、56 h菌液于A600測定吸光度，并繪制種子生長曲線。

2）溫度敏感性試驗：分別取500 μL穩(wěn)定期的P. pastoris X33雙突變菌株和P. pastoris X33誘變菌株菌液，調(diào)整菌體A600值至3.0左右，分別用YPD液體培養(yǎng)基10倍系列稀釋，取2 μL稀釋的菌懸液，分別點在YPD及YPD-sorbitol平板上，分別于28、37℃下培養(yǎng)，5～7 d后觀察菌落生長情況。

3）剛果紅敏感性試驗：分別取500 μL穩(wěn)定期的P. pastoris X33雙突變菌株和P. pastoris X33誘變菌株菌液，調(diào)整A600值至5.0左右，分別用新鮮的YPD液體培養(yǎng)基10倍系列稀釋，取5 μL稀釋的菌懸液，分別點在YPD和YPD + Congo red（50 μg/mL）平板上，置28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5～7 d后，觀察菌落生長情況。

4）菌體形態(tài)觀察：分別取5 μL 28℃培養(yǎng)的P. pastoris X33雙突變菌株和P. pastoris X33誘變菌株菌液，點于載玻片上，將涂片在火焰上固定，待冷，滴加染液，染1～3 min，水洗，待干，鏡檢。用華東師范大學(xué)電子顯微鏡中心投射電子顯微鏡（HT7700HITACHI，是日立高新技術(shù)公司為生物、制藥、納米技術(shù)和軟材料等領(lǐng)域而開發(fā)的最先進(jìn)的透射電子顯微鏡）進(jìn)行拍照，對比P. pastoris X33雙突變菌株和P. pastoris X33誘變菌株的細(xì)胞形態(tài)。

5）細(xì)胞存活率檢測：分別挑取P. pastoris X33雙突變菌株和P. pastoris X33誘變菌株，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，以l∶10的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，同時接種于YPD-sorbitol液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)。分別于0、10、20、30、40、50、60 h時取樣，稀釋，臺盼藍(lán)染色，鏡檢，計數(shù)死細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計算存活率。每個樣品共計數(shù)500個細(xì)胞，繪制細(xì)胞存活率—時間曲線。

6）GM-CSF在菌株中的表達(dá)與分析：將雙突變菌、誘變菌、野生菌和單敲除菌接種到2 mL的YPD（蛋白胨2 g/dL，酵母提取物1 g/dL，葡萄糖2 g/dL）培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h后，以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到100 mL的BMGY（蛋白胨2 g/dL，酵母提取物1 g/dL，YNB 1.34 g/dL，甘油2%，100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0）培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，離心去上清液并重懸于15 mL的BMMY（酵母提取物1 g/dL，YNB 1.34 g/dL，蛋白胨2 g/dL，100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH6.0）培養(yǎng)基中，同時加入2%的甲醇開始誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)72 h結(jié)束后離心取上清液，超濾濃縮后用于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。

2　結(jié)果與討論

2.1誘變實驗富集結(jié)果

2.1.1紫外誘變實驗富集結(jié)果每一輪紫外誘變過后都進(jìn)行數(shù)次富集篩選，具體做法是將一輪誘變后生長速度較快的畢赤酵母菌混合，再涂板，以尋找其中生長速度最快的，篩選條件主要是觀察菌落直徑和菌落生長速度。這樣經(jīng)過3輪紫外誘變，十幾次富集篩選，篩選到了一些生速度加快的菌株。由圖1可以看出，經(jīng)過三輪紫外誘變的菌的菌落比雙突變菌大。

圖1　第三輪紫外誘變富集結(jié)果(培養(yǎng)5 d)Fig. 1 Third round of ultraviolet mutagenesis enrichment results (cultured for 5 days)

2.1.2 ARTP誘變實驗富集結(jié)果同樣，一輪ARTP誘變后也進(jìn)行數(shù)次富集篩選，尋找生長速度最快的菌株，這樣再經(jīng)過一輪ARTP誘變實驗，篩選到了比紫外誘變菌株生長速度更快的菌株。由圖2可知，經(jīng)過3輪紫外誘變，再經(jīng)過一輪ARTP誘變后，得到了生長速度更快的菌株。

2.2誘變實驗富集結(jié)果

2.2.1菌株的生長情況將X-33雙突變菌株和X-33誘變菌株分別接種于新鮮的YPD+sorbitol培養(yǎng)基中，于28℃、215 r/min振蕩培養(yǎng)，測定A600值，以時間（h）為橫坐標(biāo)，A600值為縱坐標(biāo)，作生長曲線，見圖3。

圖2　ARTP誘變富集結(jié)果(培養(yǎng)7 d)Fig. 2　 Results of enrichment of ARTP mutagenesis(cultured for 7 days)

圖3　標(biāo)準(zhǔn)條件下P. pastoris X33雙突變菌株和P. pastoris X33誘變菌株的生長曲線Fig. 3　 Growth curve of the double mutant X33 and mutagenesis X33 under standardized conditions

由圖3可以看出，在同等培養(yǎng)條件下，在一定的時間范圍內(nèi)，P. pastoris X33誘變菌株的生長情況，與P. pastoris X33雙突變菌株相比，生長速度加快了約15%，對數(shù)期縮短，斜率更大，菌液濃度提高了約20%。說明誘變對酵母細(xì)胞的生長產(chǎn)生了影響，使畢赤酵母細(xì)胞的生長速度增加、細(xì)胞密度增加，具體原因有待進(jìn)一步分析。

2.2.2溫度對生長情況的影響溫度對畢赤酵母的生長影響比較大，在不同的溫度下，畢赤酵母的生長速度會有明顯差異，在最適溫度時，畢赤酵母的生長繁殖非常旺盛。但是敲除了必需基因后，畢赤酵母的生長能力明顯下降，即使在有1 mol/L sorbitol的情況下，生長速度也顯著降低，見圖4。

圖4　X33雙突變菌株和X33誘變菌株對溫度的敏感性Fig. 4　 Sensitivities of the double mutant X33 and mutagenesis X33 to temperature

結(jié)果顯示，X33雙突變菌株和X33誘變菌株對溫度都比較敏感，在28℃培養(yǎng)時，菌株生長狀況較好；當(dāng)培養(yǎng)溫度升至37℃后，菌株的生長受到抑制，未見生長。在37℃時補(bǔ)加1.0 mol/L sorbitol后，X33誘變菌株的致死性生長受到抑制，說明X33誘變菌對滲透壓的適應(yīng)能力有了一定提高。

2.2.3菌株對滲透壓的敏感性在正常的情況，不同的滲透壓對畢赤酵母的影響不是很大，因為畢赤酵母細(xì)胞膜有一定的緩沖能力，但是對于雙敲除菌株，它的細(xì)胞膜不完整，導(dǎo)致對滲透壓的適應(yīng)能力明顯下降，見圖5。

檢測結(jié)果顯示，用剛果紅染菌落，野生菌細(xì)胞壁完整，雙突變菌株細(xì)胞壁不完整，誘變菌適應(yīng)能力有所改善，但剛果紅仍為陽性，說明細(xì)胞壁也不完整。

圖5　野生菌、X33雙突變菌株和X33誘變菌株對剛果紅的敏感性Fig. 5 Sensitivities of wild strain, the double mutant X33 and mutagenesis X33 to Congo red

2.2.4菌體形態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)直接反映了菌株的具體生存情況，在正常情況下，菌株的細(xì)胞應(yīng)該是球形或者橢球形，表面比較平滑均勻。但是對于缺乏重要細(xì)胞膜相關(guān)基因的雙敲除菌株來說，它的細(xì)胞形態(tài)有了明顯的改變，見圖6—7。

圖6　X33雙突變菌株和X33誘變菌株細(xì)胞形態(tài)的電鏡觀察Fig. 6 Electron microscopy of cell morphology caused by the double mutant X33 and mutagenesis X33

圖7　X33雙突變菌株和X33誘變菌株細(xì)胞形態(tài)變化的光鏡觀察(美藍(lán)染色，×100）Fig. 7 Optical microscopy of cell morphology caused by the double mutant X33 and mutagenesis X33 (methylene blue dyeing，×100)

從電鏡照片上可以看出，在進(jìn)入穩(wěn)定期后，X33誘變菌株與X33雙突變菌株相比，母細(xì)胞未與子細(xì)胞完全分離就又重新出芽的現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)，見圖6。美藍(lán)染色結(jié)果同樣驗證了上面的結(jié)論，見圖7。

2.2.5菌株的存活率將X-33雙突變菌株和X-33誘變菌株分別接種于新鮮的YPD+sorbitol培養(yǎng)基中，于28℃、215 r/min振蕩培養(yǎng)，每10小時測定一次細(xì)胞存活率，以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，作存活率曲線，見圖8。

圖8　X33雙突變菌株和X33誘變菌株的存活率-時間曲線Fig. 8 Survival rate-time curve of the double mutant X33 and mutagenesis X33

細(xì)胞存活率-時間曲線顯示，X33雙突變菌株細(xì)胞存活率低于X33誘變菌株；在用YPD+sorbitol培養(yǎng)基培養(yǎng)時，X33雙突變菌株和X33誘變菌株的細(xì)胞存活率均明顯高于用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)時的細(xì)胞存活率，且X33誘變菌株細(xì)胞存活率比X33雙突變菌株高。

2.2.6 GM-CSF在菌株中的表達(dá)與分析由圖9可知，GM-CSF可以在野生菌和單敲除菌中良好表達(dá)，不需要濃縮；GM-CSF在雙突變菌和誘變菌中表達(dá)的上清液分別濃縮500倍后進(jìn)行SDS-PAGE分析，可以得到表達(dá)量良好的圖譜，并且誘變菌的表達(dá)量要比雙突變菌高，見圖9。同時也說明，敲除了兩個必需基因后，菌株的表達(dá)水平降低了許多。經(jīng)過冷凍干燥后由于鹽濃度太高，條帶比較寬，但是希望通過冷凍干燥來濃縮的目的并沒有達(dá)到。

圖9　GM-CSF在菌株中的表達(dá)Fig. 9 Expression of GM-CSF in strains

3　結(jié)語

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)N-糖基化代謝途徑改造的進(jìn)行使得通過發(fā)酵工程大規(guī)模生產(chǎn)復(fù)雜型糖蛋白藥物成為了可能，拓寬了酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。然而，在酵母的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，P. pastoris X33突變菌株與野生型菌株相比，生長速度很慢，可能是由于敲除了酵母的och1基因和alg3基因?qū)湍傅纳碚{(diào)節(jié)和細(xì)胞壁的形成造成了重大缺陷，從而使得生長狀態(tài)受到影響[12]。甘露糖蛋白是酵母細(xì)胞壁的主要組分，其中的甘露糖是影響細(xì)胞活性的重要組成成分，甘露糖蛋白可在細(xì)胞外形成一層保護(hù)層，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整，保護(hù)細(xì)胞免受外源物質(zhì)的破壞，因此，敲除了och1基因和alg3基因，酵母的α-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶和α-1，3甘露糖轉(zhuǎn)移酶功能缺失，這會導(dǎo)致甘露糖蛋白的糖基化出現(xiàn)缺陷，進(jìn)而破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)[3]。另外，糖基化對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞還可以通過影響合成細(xì)胞壁其他成分的功能蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)以及活性[13]。

通過紫外誘變的方法，可以改變酵母的一系列基因，這樣就有可能打開正常情況下不開啟的代謝途徑?；蛲蛔兛梢栽鰪?qiáng)一些酶的活性以及改變一些酶的性質(zhì)，進(jìn)而有可能使現(xiàn)有代謝途徑的效率提高或者發(fā)生有益的改變。經(jīng)過4輪誘變后，發(fā)現(xiàn)P. pastoris X33誘變菌株的生長速度比P. pastoris X33雙突變菌株提高了20%左右。在37℃培養(yǎng)時，X33誘變菌株可以在帶有1 mol/L sorbitol的YPD培養(yǎng)基上生長，而X33雙突變菌株不能。細(xì)胞壁完整性的破壞增加了細(xì)胞對一些細(xì)胞壁抑制性藥物（如剛果紅）及環(huán)境因素（如溫度）的敏感性。細(xì)胞形態(tài)觀察顯示，處于穩(wěn)定期的X33雙突變菌株母細(xì)胞仍未與子細(xì)胞完全分離，就又有新的子細(xì)胞出現(xiàn)，這一現(xiàn)象在X33誘變菌株中有所改善。另外菌株的表達(dá)量也有所提升。

畢赤酵母具有表達(dá)水平高、基因操作簡單、生產(chǎn)成本低、不產(chǎn)生內(nèi)毒素和可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，又具有真核細(xì)胞許多翻譯后修飾功能如糖基化修飾，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種外源重組蛋白的表達(dá)。但是畢赤酵母對蛋白糖基化修飾后形成高甘露糖型糖鏈，不同于哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的復(fù)雜型糖鏈，因此畢赤酵母表達(dá)的蛋白尤其是藥用糖蛋白在用作治療時，會產(chǎn)生很多問題，如半衰期短、產(chǎn)生較高的免疫原性、易被清除等，嚴(yán)重限制了畢赤酵母在生產(chǎn)藥用蛋白中的應(yīng)用。因此人們希望通過改變畢赤酵母的糖基化代謝途徑，使產(chǎn)生類似于哺乳動物細(xì)胞的復(fù)雜型糖鏈，以提高它的使用價值。

綜上所述，作者研究了P. pastoris X33雙突變菌株與P. pastoris X33誘變菌株的生理特性，為該菌株進(jìn)一步糖基化的研究奠定了一些基礎(chǔ)。相信隨著研究的深入、方法的改進(jìn)、社會需求的提高，畢赤酵母作為宿主菌生產(chǎn)動物乃至于人類的糖蛋白產(chǎn)品的愿望一定會更快實現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Juergen H Nett，Terrance A Stadheim，Huijuan Li，et al. A combinatorial genetic library approach to target heterologousglycosylation enzymes to the endoplasmic reticulum or the golgi apparatus of Pichia pastoris[J]. Yeast，2011，28：237-252.

[ 2 ] Potgieter TI，Cukan M，Drummond JE et al. Production of monoclonal antibodies by glycoengineered Pichia pastoris [J]. Journal of Biotechnology，2009，139（4）：318-325.

[ 3 ] Liu B，Gong X，Chang SH et al. Disruption of the OCH1 and MNN1 genes decrease N-glycosylation on glycoprotein expressed in Kluyveromyces lactis[J]. Journal of Biotechnology，2009，143：95-102.

[ 4 ] Jacobs PP，Geysens S，Vervecken W et al. Engineering complex-type N-glycosylation in Pichia pastoris using GlycoSwich technology[J]. Nature Protocol，2009，4：58-70.

[ 5 ]羅競紅，游自立.巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在外源基因表達(dá)中的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2007，3：75-79. LUO Jinghong，YOU Zili. Study on expression of heterologous gene in Pichia pastoris[J]. Biotechnology Bulletin，2007，3：75-79.（in Chinese）

[ 6 ] Wildt S，Gerngross T U. The humanization of N-glycosylation pathways in yeast[J]. Nat Microbiol，2005，3（2）：119-128.

[ 7 ] Hamilton R，Gerngross U. Glycosylation engineering in yeast：the advent of fully humanized yeast[J]. Current Opinion in Biotechnology，2007，18（5）：387-392.

[ 8 ] Bobrowicz P，Davidson RC，Li H et al. Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in core oligosaccharide assembly in the yeast Pichia pastoris：production of complex humanized glycopreteins with terminal galactose [J]. Glycobiology，2004，14（9）：757-766.

[ 9 ]王書全，李明，馬鳴瀟.一種新型雜合抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性[J].中國生物制品學(xué)雜志，2011，24（2）：173-175，178. WANG Shuquan，LI Ming，MA Mingxiao. Expression of a novel hybrid antibacterial peptide in Pichia pastoris and its antibacterial activity[J]. Chin J Biological，2011，24（2）：173-175，178.（in Chinese）

[10] Hashimoto S，Ogura M，Aritomi K et al. Isolation of auxotrophic mutants of diploid industrial yeast strains after UV mutagenesis [J]. Appl Environ Microbiol，2005，71（1）：312-319.

[11] Stephen R Hughes，William R Gibbons. Random UV-C mutagenesis of Scheversomyces（formerly Pichia）stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars[J]. J Ind Microbiol Biotechnol，2012，39：163-173.

[12]許永利，張大成，朱瑞宇，等.畢赤酵母X-33糖基化突變菌株的生理特性[J].中國生物制品學(xué)雜志，2011，24（4）：439-442. XU Yongli，ZHANG Dacheng，ZHU Ruiyu，et al. Physiological property of Pichia pastoris X-33 glycosylation mutant[J]. Chin J Biological，2011，24（4）：439-442.（in Chinese）

[13] Martin Schmidt，Meghan E Strenk et al. Importance of cell wall mannoproteins for septum formation in Saccharomyccs cerevisiae [J]. Yeast，2005，22（9）：715-723.

Mutation Breeding of Double Deficient Mutant Pichia pastoris X33 Strain

GU Pengfei1，2，LI Meng1，2，ZHU Ruiyu1，2，JIN Jian1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：To promote the application of α-1, 6-mannose transferase (OCH1p) and α-1, 3-mannose transferase (ALG3p) double mutant strain of Pichia pastoris X33 (och1 alg3 mX33) as host for protein expression and to lay the foundation for the further glycosylation of the double mutant strain, this study wants to increase the growth rate as well as the ability to adapt of the double mutant strain through ultraviolet mutagenesis and Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP) mutagenesis methods. At last, after four rounds of screening, a double mutant strain was found to be 15% increase in growth speed, the decrease in temperature sensitivity, and the improvement in cell survival rate.

Keywords：glycosylation，mutagenesis，growth phenotype，mannose transferase

*通信作者：金堅（1930—），男，江蘇蘇州人，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事長效重組蛋白藥物與腫瘤多藥耐藥機(jī)制方面的研究。E-mail：jinjian31@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81101667）；江蘇省基礎(chǔ)研究計劃（自然科學(xué)基金）項目（BK2009071）。

收稿日期：2014-07-24

中圖分類號：Q 815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）02—0129—07