99mTc -帕米膦酸鹽的制備及骨分布

羅洪義，沈浪濤，梁積新，楊春慧，張文輝，秦少鵬，衛(wèi)成軍，劉海春， 王建華，李洪玉

(1.中國原子能科學(xué)研究院 同位素研究所，北京　102413；

2.原子高科股份有限公司，北京　102413；3.核工業(yè)401醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科, 北京　102413)

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99mTc -帕米膦酸鹽的制備及骨分布

羅洪義1，沈浪濤2，梁積新1，楊春慧2，張文輝2，秦少鵬1，衛(wèi)成軍1，劉海春3， 王建華3，李洪玉2

(1.中國原子能科學(xué)研究院 同位素研究所，北京102413；

2.原子高科股份有限公司，北京102413；3.核工業(yè)401醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科, 北京102413)

摘要：為觀察(99m)Tc標(biāo)記的帕米膦酸鹽(Pamidronate，PAM)的骨分布特點，以氯化亞錫為還原劑，優(yōu)化(99m)Tc直接標(biāo)記PAM的條件，研究SnCl2(Ⅱ)含量、配體用量、pH及反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響，確定了優(yōu)化的標(biāo)記條件；考察(99m)Tc-PAM的體外穩(wěn)定性；評價(99m)Tc-PAM在正常鼠體內(nèi)的生物分布，尤其是骨攝取情況，比較(99m)Tc-PAM與(99m)Tc-MDP在正常小鼠體內(nèi)的骨攝取。實驗結(jié)果表明，PAM的(99m)Tc標(biāo)記方法簡單，標(biāo)記率大于95%，標(biāo)記物體外穩(wěn)定性好。正常鼠體內(nèi)分布實驗發(fā)現(xiàn)，(99m)Tc-PAM骨攝取很高，且滯留時間長，在血液中清除快，在體內(nèi)主要通過腎代謝；正常大鼠SPECT顯像骨組織清晰可見，具有很好骨顯像效果。與(99m)Tc-MDP在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果比較表明，(99m)Tc-PAM的骨放射性攝取及骨與血放射性攝取比在不同時相均優(yōu)于(99m)Tc-MDP。研究表明，(99m)Tc-PAM具有理想的骨顯像性能，可用于骨顯像、骨損傷探測以及腫瘤骨轉(zhuǎn)移檢測等應(yīng)用研究。

關(guān)鍵詞：骨顯像劑；(99m)Tc-帕米膦酸鹽；生物分布；SPECT顯像；(99m)Tc-亞甲基二膦酸鹽

自20世紀(jì)70年代初99mTc標(biāo)記的親骨顯像劑問世以來，放射性核素骨顯像已在臨床得到廣泛應(yīng)用，并成為核醫(yī)學(xué)科中的一個重要分支。目前臨床上使用的骨顯像劑主要是99mTc標(biāo)記的磷酸鹽類和膦酸鹽類，其中以锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽(99mTc-MDP )使用最廣泛[1]。99mTc-MDP主要用于各種骨骼系統(tǒng)疾病的早期診斷，包括骨代謝病、骨腫瘤與骨轉(zhuǎn)移瘤等，尤其是早期診斷惡性腫瘤有無骨轉(zhuǎn)移，在臨床實踐中起到了非常重要的作用。由于99mTc-MDP從血液和軟組織中清除相對較慢，藥物注射和骨顯像之間等待時間較長，臨床應(yīng)用有一定局限性[2]。

帕米膦酸二鈉(3-amino-1-hydroxypropylidene-1-biophosphonic acid，PAM)是德國Henkel公司研發(fā)的第二代二膦酸鹽類藥物，1989年首次在英國上市，臨床用于惡性腫瘤并發(fā)的高鈣血癥和溶骨性癌轉(zhuǎn)移引起的骨痛[3-4]。由于此類藥物對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病灶的良好效果，已被美國FDA批準(zhǔn)用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病灶治療。帕米膦酸二鈉的化學(xué)結(jié)構(gòu)是3-氨基-1-羥基丙叉-1,1-雙膦酸鹽，與中心碳原子相連的一端側(cè)鏈為羥基(-OH)，可以顯著提高其對骨的親和力；另一端側(cè)鏈為伯氨基(-CH2CH2NH2)，可以提高與99mTc的絡(luò)合能力[5]。Kumar等[6-7]發(fā)現(xiàn)99mTc標(biāo)記帕米膦酸鹽在正常骨與骨損傷中骨攝取均高于99mTc-MDP，腎臟與軟組織清除均較99mTc-MDP快。

近年來，99mTc的同質(zhì)異能體99Tc標(biāo)記的亞甲基二膦酸鹽即99Tc-MDP(商品名為云克)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病及骨科疾病治療方面取得了突破進(jìn)展，已廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、股骨頭壞死與骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，其療效已經(jīng)在臨床上得到了肯定[8-9]。99Tc-MDP是一種我國自主開發(fā)研制的放射性標(biāo)記藥品，其成功研制促進(jìn)了對新一代二膦酸鹽類治療藥物的探索。

本研究擬通過99mTc直接標(biāo)記PAM，評價標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性以及動物體內(nèi)的生物分布情況，并與99mTc-MDP進(jìn)行對比，探討99mTc-PAM作為骨顯像劑的特點，以期得到一種更理想的骨顯像劑，并為進(jìn)一步開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療等的新一代放射性標(biāo)記藥物99Tc-PAM提供參考。

1實驗部分

1.1實驗材料

99Mo-99mTc發(fā)生器：原子高科股份有限公司；FH463A自動定標(biāo)器、FT-603型閃爍探頭：北京核儀器廠；CRC15R放射性活度計：美國CAPINTEC公司；BS124S電子天平：德國Sartorius公司；BFX4-320低速自動平衡離心機(jī)：白洋離心機(jī)廠；1470自動伽瑪計數(shù)器：Perkin Elmer公司；N2-522 E. CAM雙探頭SPECT：德國西門子公司。

帕米膦酸鈉(Pamidronate，PAM)：自行合成，結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜分析等確認(rèn)[10]；MDP藥盒：原子高科股份有限公司；SnCl2·2H2O：美國阿爾法試劑公司；鹽酸，丙酮，氫氧化鈉，甲醇，丁酮，無水乙醇，乙腈等均采用國產(chǎn)分析純試劑；實驗用水均為二次去離子水。

昆明種小白鼠：雌性，(20±2.0) g，45只，清潔級；Wistar大鼠：雌性，(220±20) g，24只，清潔級。均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供。

1.2實驗方法

1.2.299mTc-PAM的標(biāo)記率及放化純度99mTc-PAM的標(biāo)記率和放化純度采用快速薄層層析法(ITLC)測定，以快速薄層硅膠板(ITLC-SG)為支持體，展開體系1為丁酮，體系2為鹽酸與甲醇的混合液V(HCL)∶V(甲醇)=5∶95，采用上行色譜法，展開距離為10 cm。放射性計數(shù)采用γ計數(shù)器測定。

1.2.3體外穩(wěn)定性取1.2.1節(jié)所得0.1 mL99mTc-PAM溶液(約37 MBq)加入至0.9 mL 10%的胎牛血清(用pH=7.4的PBS稀釋)中，震蕩搖勻，37 ℃下溫育，分別于0、1、2、4、6 h后，取出0.1 mL混合液加入離心管中，再加入0.2 mL乙腈，常溫4 000 r/min離心5 min，取上清液，用1.2.2方法測定其放化純度(RCP)，并與標(biāo)記物在生理鹽水中的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。

1.2.499mTc-PAM及99mTc-MDP在正常小鼠體內(nèi)生物分布取雌性昆明小白鼠45只，隨機(jī)分組，每組5只。經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL99mTc-PAM或99mTc-MDP溶液(約0.74 MBq)，于注射后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h(沒有做99mTc-MDP的4 h體內(nèi)生物分布實驗)斷頸處死，取血、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、頭蓋骨、股骨等組織，稱重，測量其放射性計數(shù)并進(jìn)行衰減校正，計算每克組織的放射性攝取占總注射量的百分?jǐn)?shù)(%ID/g)。并對99mTc-PAM和99mTc-MDP在正常小鼠體內(nèi)的生物分布進(jìn)行比較。

1.2.5正常大鼠的體內(nèi)生物分布取雌性Wistar大鼠20只，隨機(jī)分組，每組5只。經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL99mTc-PAM溶液(約5.5 MBq)，于注射后30 min、1 h、2 h、3 h斷頸處死，取血、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、股骨及頭蓋骨等稱重，測量其放射性計數(shù)并進(jìn)行衰減校正，計算每克組織的放射性攝取占總注射量的百分?jǐn)?shù)(%ID/g)。

1.2.6正常大鼠的SPECT顯像取雌性Wistar大鼠4只，經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL99mTc-PAM溶液(約18.5 MBq)。分別于注射2 h、4 h后進(jìn)行SPECT顯像，于顯像前10 min經(jīng)腹腔注射1 mL 10%水合氯醛溶液行全身麻醉。顯像時，99mTc能窗采用140 keV，顯像數(shù)據(jù)在計算機(jī)系統(tǒng)128× 128矩陣中進(jìn)行記錄與分析。放大倍數(shù)為1；采集放射性計數(shù)：300 000/只。

2結(jié)果與討論

2.1PAM的99mTc標(biāo)記條件

還原劑SnCl2對99mTc-PAM標(biāo)記率的影響示于圖1。

圖1　SnCl2濃度對標(biāo)記率的影響Fig.1　Influence of SnCl2 concentration on radiolabeling yield of 99mTc-PAM

從圖1中可以看出，當(dāng)SnCl2的濃度在0.1～0.6 g/L范圍內(nèi)，標(biāo)記率均在90%以上，而當(dāng)濃度增大到0.7 g/L時，標(biāo)記率下降至80%左右。可能原因是SnCl2含量過高時,容易生成99mTcO2膠體，造成標(biāo)記率偏低。SnCl2濃度為0.5g/L時，99mTc-PAM標(biāo)記率達(dá)95%以上，本實驗中均采用SnCl2濃度為0.5 g/L。

配體PAM用量對99mTc-PAM標(biāo)記率的影響示于圖2。由圖2可知，標(biāo)記率隨PAM濃度的增大而增加，當(dāng)PAM濃度為5.0 g/L時，標(biāo)記率達(dá)97.2%。

pH對99mTc-PAM標(biāo)記率的影響如圖3所示，從圖3中可以看出，當(dāng)pH為5～8時，標(biāo)記率均大于90%。但當(dāng)pH繼續(xù)增大時，標(biāo)記率顯著降低，考慮到實際應(yīng)用,本實驗中選擇pH為6.0。

反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響見圖4。由圖4可知，反應(yīng)15 min時，標(biāo)記率即達(dá)到95%以上。時間延長，標(biāo)記率基本保持不變。時間不是影響標(biāo)記率的主要因素，該標(biāo)記反應(yīng)在短時間內(nèi)即可達(dá)到很高的標(biāo)記率。因此將反應(yīng)時間定為15 min。

圖2　配體PAM濃度對標(biāo)記率的影響Fig.2　Influence of PAM concentraiont on radiolabeling yield of 99mTc-PAM

圖3　pH對標(biāo)記率的影響Fig.3　Influence of pH value on radiolabeling yield of 99mTc-PAM

圖4　反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響Fig.4 Influence of reaction time on radiolabeling yield of 99mTc-PAM

2.299mTc-PAM標(biāo)記率及放化純度

2.3體外穩(wěn)定性

99mTc-PAM在生理鹽水與10%胎牛血清中的體外穩(wěn)定性結(jié)果示于圖5。

圖5　99mTc-PAM在生理鹽水與小牛血清中的體外穩(wěn)定性Fig.5　In vitro stability of 99mTc-PAM in saline and calf serum

由圖5可知，99mTc-PAM在生理鹽水中具有良好的穩(wěn)定性，于室溫下放置6 h后，標(biāo)記物未見明顯分解，放化純度仍在95%以上。99mTc-PAM在10%胎牛血清中具有較好的穩(wěn)定性，2 h后放化純度仍高于90%，但隨著時間延長緩慢分解，6 h后其放化純度約為70%。

2.499mTc-PAM在正常鼠體內(nèi)的生物分布

2.4.1在正常鼠體內(nèi)的生物分布及與99mTc-MDP的比較99mTc-PAM在正常小鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果見圖6。由圖6可知，99mTc-PAM骨攝取很高，在給藥后2 h時，達(dá)到峰值為(41.20±6.87)%，骨中滯留時間長，在給藥后4 h時，仍高達(dá)(30.30±2.31)%；血清除很快，在給藥后4 h，骨與血放射性攝取比高達(dá)303；標(biāo)記物在腎中有少量的攝取，這由標(biāo)記物具有較高水溶性的藥物性質(zhì)決定(經(jīng)測量，99mTc-PAM的脂水分配系數(shù)P=0.004 65，logP=-2.33)。心、肝、肺等重要臟器放射性攝取非常少，幾乎可以忽略不計，提示重要臟器的放射性受累很小。

圖6　99mTc-PAM在正常昆明種小鼠體內(nèi)分布Fig.6　Biodistribution of 99mTc-PAM

99mTc-PAM在正常Wistar大鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果見圖7。99mTc-PAM在Wistar大鼠中同樣表現(xiàn)很高骨攝取，給藥后3 h，骨攝取為(12.93±2.84)%。而且放射性攝取在重要臟器如心、肝臟、肺中比在昆明小鼠中清除更快(顯著性差異，p<0.05)。

99mTc-PAM和99mTc-MDP在小鼠骨骼內(nèi)放射性攝取率隨骨與血放射性攝取比隨時間變化示于圖8。綜合比較99mTc-PAM和99mTc-MDP在小鼠體內(nèi)的生物分布，結(jié)果顯示，99mTc-PAM的骨攝取比99mTc-MDP高，血與軟組織清除速度更快，在肝腎等重要臟器中放射性濃集更少，臟器放射性受累低。各個時間點的骨與血、骨與肉放射性攝取比均高于99mTc-MDP，具有較明顯的骨顯像優(yōu)勢。

圖7　99mTc-PAM在正常Wistar大鼠體內(nèi)的生物分布Fig.7　Biodistribution of 99mTc-PAM

2.4.2大鼠SPECT骨顯像正常大鼠在給藥2 h、4 h后全身SPECT顯像圖示于圖9。

圖8　99mTc-PAM和99mTc-MDP在小鼠體內(nèi)骨攝取及骨與血放攝性攝取比Fig.8　Comparison of bone uptake 99mTc-PAM and 99mTc-MDP in mice

圖9　99mTc-PAM在正常大鼠的全身SPECT顯像圖Fig.9　SPECT image of 99mTc-PAM in Wistar rats

從圖9結(jié)果可見，99mTc-PAM注射2 h后骨顯像圖像清晰，尤其是骨關(guān)節(jié)處放射性濃集強(qiáng)；給藥后4 h，由于99mTc-PAM在血中清除快速，其他軟組織攝取低，此時大鼠骨骼顯像更加清晰，圖像質(zhì)量好。

3小結(jié)

采用獨立變量法研究了99mTc-PAM制備過程中各種影響因素對標(biāo)記率的影響，優(yōu)化了制備99mTc-PAM的標(biāo)記條件。

正常小鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果表明，99mTc-PAM 骨攝取很高，血清除快，在肝脾等重要臟器中濃集少，在體內(nèi)主要經(jīng)腎代謝且代謝速度快，具備了作為理想骨顯像劑的體內(nèi)分布特點及藥代動力學(xué)性質(zhì)；與99mTc-MDP比較，99mTc-PAM的骨攝取高，血清除快，重要臟器的放射性攝取低，放射性受累小。99mTc-PAM在大鼠體內(nèi)的生物分布及SPECT顯像結(jié)果與在小鼠體內(nèi)分布結(jié)果一致，提示其可作為性質(zhì)優(yōu)良的骨顯像劑。

以上實驗結(jié)果表明，99mTc-PAM可以作為骨顯像劑用于骨骼疾病以及與骨代謝相關(guān)疾病的診斷。同時其骨分布特點提示，與99Tc-MDP類似，可以研發(fā)99Tc-PAM用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類等自身免疫疾病的治療，有望開發(fā)新一代放射性標(biāo)記藥物。

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Preparation and Biodistribution of99mTc-Pamidronate as Bone Imaging Agent

LUO Hong-yi1, SHEN Lang-Tao2, LIANG Ji-xin1, YANG Chun-hui2, ZHANG Wen-Hui2,QIN Shao-peng1, WEI Cheng-jun1, LIU Hai-Chun3, WANG Jian-Hua3, LI Hong-yu2

(1.DepartmentofIsotopes,ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China;2.HTACO.,LTD.,Beijing102413,China；3.ChinaNuclearIndustryBeijing401Hospital,Beijing102413,China)

Abstract:Labeling of Pamidronate (PAM) with (99m)Tc was studied by a direct labeling method in the presence of SnCl2·2H2O as reducing agent. The influences of the concentration of SnCl2·2H2O, PAM concentration and pH value, reaction time on labeling yield were investigated. The optimum labeling was determined. The results showed that the radiochemistry purity of (99m)Tc-PAM was more than 95%. Biodistribution studies in normal mice and rats showed very high uptake of (99m)Tc-PAM and long retain in bone. (99m)Tc-PAM was washed out from the blood very quickly. In addition, considerable uptake in the kidneys indicated this complex was excreted mainly by renal pathway. On the other hand, the radioactivity in liver, lung and heart was negligible. It could be known from SPECT images that (99m)Tc-PAM would be an excellent bone-imaging agent. Bone uptake of (99m)Tc-PAM was higher than that of (99m)Tc-MDP in mice. This study suggested that (99m)Tc-PAM was a promising bone imaging agent and further study was worthwhile.

Key words：bone imaging agent; (99m)Tc-PAM; biodistribution; SPECT imaging; (99m)Tc-MDP

doi：10.7538/tws.2016.29.01.0006

中圖分類號：R817.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)01-0006-06

作者簡介：羅洪義(1980—)，湖南長沙人，高級工程師，放射性藥物專業(yè)通信作者：梁積新，研究員，E-mail: 772821209@qq.com

收稿日期：2014-10-15;修回日期：2016-01-06