胸腺嘧啶-15N2的合成與表征

徐建飛，杜曉寧，王　偉，雷　雯，侯　捷

(上海化工研究院 同位素研究所，上?！?00062)

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胸腺嘧啶-15N2的合成與表征

徐建飛，杜曉寧，王偉，雷雯，侯捷

(上?；ぱ芯吭?同位素研究所，上海200062)

摘要：以甲酸乙酯和丙酸乙酯為原料，在金屬鈉存在下縮合得到中間體2-甲酰丙酸乙酯，中間體在酸催化下與同位素尿素-(15)N2縮合，在甲醇鈉作用下環(huán)化反應(yīng)得到胸腺嘧啶-(15)N2。合成方法操作簡(jiǎn)單，工藝流程短，副產(chǎn)物少，收率可達(dá)80%，(15)N同位素豐度穩(wěn)定。產(chǎn)物經(jīng)HPLC、IR、MS、1H NMR和(13)C NMR表征，結(jié)果表明：產(chǎn)物化學(xué)純度>99%，(15)N同位素豐度>98 atom%。

關(guān)鍵詞：同位素；胸腺嘧啶；2-甲酰丙酸乙酯

胸腺嘧啶又稱5-甲基尿嘧啶，在藥物合成中應(yīng)用較廣。胸腺嘧啶為DNA所需的4種基本堿基之一，具有一定的藥理作用，可以合成抗癌藥物胸腺嘧啶氮芥；與其他脫氧核糖核苷(如脫氧胞苷、脫氧鳥嘌呤核苷、脫氧腺苷)合用，能顯著促進(jìn)傷口愈合[1]。以胸腺嘧啶為中間體可以合成一系列抗病毒藥物，如齊多夫定和司他夫定等[2-3]。

標(biāo)記胸腺嘧啶及其核苷是研究脫氧核糖核酸(DNA)的生物合成、染色體的復(fù)制等生命活動(dòng)的重要示蹤劑[4]。應(yīng)用標(biāo)記胸腺嘧啶摻入法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)速率是真實(shí)反映細(xì)菌活性和功能的重要手段，能真實(shí)反映細(xì)菌生理狀態(tài)，并將此法應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[5]、水生微生物學(xué)[6]、土壤科學(xué)等領(lǐng)域[7]。標(biāo)記胸腺嘧啶摻入法測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，是目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能水平的重要指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)與臨床免疫的研究工作[8]。

文獻(xiàn)報(bào)道的胸腺嘧啶合成路線主要有以下4種。(1) 以α-甲基氰乙酸為原料，在醋酐溶液中與尿素縮合，再經(jīng)鉑或鈀催化加氫環(huán)合得到胸腺嘧啶[9]。(2) 以丙酸乙酯、甲酸乙酯、硫脲、雙氧水等為原料，經(jīng)縮合、環(huán)合、氧化及中和4步反應(yīng)，合成胸腺嘧啶產(chǎn)品，反應(yīng)總收率達(dá)64.5%[10]。(3) 以丙酸乙酯、氯甲酸乙酯、苯甲酰氯等為原料，經(jīng)縮合、氯化、氧化、酸化和環(huán)合5步反應(yīng)，制備得到胸腺嘧啶[11]。(4) 以α-甲基丙烯酸為原料，經(jīng)溴化和酰氯化制得中間體2,3-二溴-2-甲基-丙酰氯，中間體再與尿素縮合，然后在甲醇鈉的作用下環(huán)合得到胸腺嘧啶。以上各種方法均存在合成路線較長(zhǎng)，操作不便等缺點(diǎn)，且部分方法中較難以引入同位素標(biāo)記原料，造成目標(biāo)產(chǎn)物胸腺嘧啶-15N2的合成困難。綜合以上方法，本研究擬以甲酸乙酯和丙酸乙酯為原料，在金屬鈉存在下縮合得到中間體2-甲酰丙酸乙酯，中間體在酸催化下與同位素尿素-15N2縮合，再在甲醇鈉作用下環(huán)化反應(yīng)得到胸腺嘧啶-15N2。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與裝置

7890B-7000C氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司，配有EI離子源及Qualitative Analysis B.06.00色譜工作站；LC-MS 2020液質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Lab Solutions系統(tǒng)工作站；Magna-IR-550型紅外光譜儀：美國(guó)Nicolet產(chǎn)品，KBr壓片制樣；Bruker AV 400 MHz核磁共振：德國(guó)Bruker產(chǎn)品，配有超屏蔽超導(dǎo)磁體系統(tǒng)。

1.2主要材料與試劑

尿素-15N2：99.2 atom%15N，上海化工研究院研制；丙酸乙酯、甲酸乙酯：分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；胸腺嘧啶：標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)AccuStandard公司產(chǎn)品；其余均為市售的國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3合成方法

胸腺嘧啶-15N2合成路線如圖1所示。

250 mL三口圓底燒瓶中加入溶劑無水乙醚，混合0.3 mol甲酸乙酯和0.2 mol丙酸乙酯。攪拌中加入0.2 mol金屬鈉，水浴10 ℃反應(yīng)，N2保護(hù)。反應(yīng)液逐漸變渾濁，顏色由乳白色變成微黃色，最終成橙黃色，反應(yīng)時(shí)間為24 h。反應(yīng)結(jié)束后，加水?dāng)嚢?，?0 mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH=5，用乙醚萃取，飽和氯化鈉水洗，無水硫酸鈉干燥，旋干后得到橙黃色透明液體2-甲酰丙酸乙酯[11-12]。

將50 mmol尿素-15N2和50 mL甲醇混合，加入40 mmol 2-甲酰丙酸乙酯和3 g濃鹽酸于三口燒瓶中，60 ℃攪拌反應(yīng)。回流5 h后加入6 g甲醇鈉至反應(yīng)液中，繼續(xù)60 ℃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)4 h左右。用稀硫酸調(diào)節(jié)pH=5，結(jié)晶得到固體為黃色，加水溶解，活性炭脫色，冷卻結(jié)晶得無色固體胸腺嘧啶-15N2，收率為80%(以尿素-15N2計(jì))。

圖1　胸腺嘧啶-15N2的合成路線Fig.1　Synthesis of thymine-15N2

2結(jié)果與討論

2.1合成條件

考慮到合成反應(yīng)中影響因素較多，擬采用正交實(shí)驗(yàn)法，對(duì)反應(yīng)機(jī)理和單因素反應(yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，確定3個(gè)影響因素分別為：反應(yīng)溫度(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比(C)，并以產(chǎn)物的收率作為考核指標(biāo)，因素與水平的選擇列于表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2，方差分析列于表3。

由表2可以看出，各因素對(duì)胸腺嘧啶收率的影響次序由大到小為：尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比(C)>反應(yīng)時(shí)間(B)>反應(yīng)溫度(A)。由表3可知，尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比(C)對(duì)胸腺嘧啶收率有極顯著的影響，而其他2個(gè)因素對(duì)胸腺嘧啶收率的影響則有限。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，反應(yīng)的最優(yōu)化條件是A3B2C2，即反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為5 h，尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比1.2∶1。最優(yōu)條件二次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均結(jié)果胸腺嘧啶收率為81%，與正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)論吻合。

表1　正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表2　L9(33)的正交實(shí)驗(yàn)

表3　方差分析

2.2結(jié)構(gòu)表征

2-甲酰丙酸乙酯：橙黃色液體，收率為95.8%。GC-MS：tR=5.3 min時(shí)，主峰為中間體2-甲酰丙酸乙酯(見圖2)；主峰EI-MSm/z：C6H10O3130.2[M]，102.2[M-C2H5+H]，85.2[M-C2H5-CH3+H]，56.2[M-C2H5-CH3-CHO+H]，分子離子峰與碎片峰與理論值相符(見圖3)。

胸腺嘧啶-15N2：無色固體，HPLC經(jīng)外標(biāo)法定量計(jì)算化學(xué)純度為99.1%(見圖4)。1H NMR (DMSO-D6，400 MHz) ，δ：1.75[s，3 H，CH3]，7.27 (s，1 H，CH)；13C NMR(DMSO-D6)，δ：11.72，107.66，137.63，151.46，164.87；ESI-MSm/z：129[M+H]+(見圖5)，經(jīng)計(jì)算15N同位素豐度為98.5%。

圖2　2-甲酰丙酸乙酯的GC譜圖Fig.2　GC of ethyl 2-formylpropionate

圖3　2-甲酰丙酸乙酯的EI-MS譜圖Fig.3　EI-MS of ethyl 2-formylpropionate

圖4　胸腺嘧啶-15N2的HPLC譜圖Fig.4　HPLC of thymine-15N2

在紅外譜圖(見圖6)中，IR(KBr)，ν/cm-1： 3 199，3 062，2 927，1 729，1 677，1 440，1 207；解析為3 199、3 062 cm-1處為N-H的伸縮振動(dòng)峰，在2 927 cm-1處為CH3的吸收特征峰，在1 927 cm-1處為CO伸縮振動(dòng)峰，1 677、1 440 cm-1處為N-H的彎曲振動(dòng)峰，1 201 cm-1處為C-H的彎曲振動(dòng)峰。

圖5　胸腺嘧啶-15N2的MS譜圖Fig.5　MS of thymine-15N2

圖6　胸腺嘧啶-15N2的IR譜圖Fig.6　IR of thymine-15N2

3結(jié)論

以甲酸乙酯和丙酸乙酯為原料經(jīng)兩步反應(yīng)合成胸腺嘧啶-15N2，并用HPLC、IR、MS、1H NMR和13C NMR對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行表征，確定其結(jié)構(gòu)、化學(xué)純度和同位素豐度。該方法制備目標(biāo)產(chǎn)物路線簡(jiǎn)潔、高效，得到的化合物為進(jìn)一步研究同位素標(biāo)記嘧啶衍生物提供參考。

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Synthesis and Characterization of Thymine-15N2

XU Jian-fei, DU Xiao-ning, WANG Wei, LEI Wen, HOU Jie

(ResearchInstituteofIsotope,ShanghaiResearchInstituteofChemicalIndustry,Shanghai200062,China)

Abstract:A novel and mild synthesis method of thymine-(15)N2 was designed. Ethyl formate and ethyl propionate as raw materials, the intermediate ethyl 2-formylpropionate was condensed under sodium metal, the target compound thymine-(15)N2 was obtained by condensation with isotope urea -(15)N2 under acid catalysis. Synthesis route had the advantages of simple operation, short process flow and less side product. The yield was more than 80% and isotope (15)N abundance did not diluted. The product was characterized by HPLC, IR, MS,1H NMR and (13)C NMR. The chemical purity was more than 99% and (15)N enrichment was more than 98 atom%.

Key words：isotope; thymine; ethyl 2-formylpropionate

doi：10.7538/tws.2016.29.01.0053

中圖分類號(hào)：TL92+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-7512(2016)01-0053-05

作者簡(jiǎn)介：徐建飛(1979—)，男，上海人，高級(jí)工程師，主要從事同位素標(biāo)記化合物的合成研究

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部科技支撐計(jì)劃專項(xiàng)(2015BAK45B01)；上海市科委地方攻關(guān)計(jì)劃課題(14DZ0511800)

收稿日期：2015-08-13;修回日期：2015-09-17