不同組織器官中華蛇根草綠原酸含量的比較研究

石金敏，徐夢菲，周　燦，鄒青偉，張曉燕*

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰442000；2.武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院，湖北武漢430000）

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不同組織器官中華蛇根草綠原酸含量的比較研究

石金敏1，徐夢菲2，周燦1，鄒青偉1，張曉燕1*

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰442000；2.武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院，湖北武漢430000）

〔摘要〕目的比較中華蛇根草不同組織器官中綠原酸的含量。方法選用Inertsil C(18)色譜柱，以甲醇-0.02％磷酸溶液（20∶80）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為325 nm，柱溫40℃。結(jié)果綠原酸在0.027～1.700 μg(r=0.999 9)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2月花期采收的中華蛇根草莖、葉、花中綠原酸的含量分別為3.39、0.77、22.79 mg/g。結(jié)論中華蛇根草不同組織器官綠原酸含量差異較大，其中花含量最高。該方法能準(zhǔn)確、快速地進行定性定量檢測，可用于中華蛇根草中綠原酸含量的測定。

〔關(guān)鍵詞〕中華蛇根草；綠原酸；高效液相色譜法

中華蛇根草Ophiorrhiza Chinensis LO為茜草科蛇根草屬的植物，是中國特有的物種，主產(chǎn)于四川、貴州、湖北、湖南、江西、安徽、福建、廣東、廣西等地?；ü诹哑趁嬗谐幔瑹o角狀附屬體或附屬體很??；萌果較小，寬不超過10毫米,花冠裂片背面有闊翅,葉基部兩側(cè)對稱或近對稱，干后常變淡紅。蛇根草屬植物約200余種，廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶，我國已知68種，該屬植物主要含有甾醇、喜樹堿、蒽醌衍生物、胡蘿卜苷和木犀草素等活性成分[1]。湖北武當(dāng)山地區(qū)地處亞熱帶和溫帶的分水嶺，氣候溫和，中華蛇根草資源非常豐富。為了考察其藥效與活性成分的關(guān)聯(lián)性，試驗發(fā)現(xiàn)其富含綠原酸[2]。因此，本文建立了HPLC測定中華蛇根草中綠原酸含量，并對不同部位的綠原酸含量進行了比較，對其進行方法學(xué)驗證，為有效控制藥材質(zhì)量及合理利用植物資源提供參考。

1材料與儀器

1.1材料

中華蛇根草樣品2月采于湖北十堰市牛頭山森林公園，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部張曉燕主任藥師鑒定為茜草科蛇根草屬植物中華蛇根草Ophiorrhiza chinensis LO。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98％，批號:110753-200413）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2儀器

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀（島津有限公司）；KQ-500DV超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004萬分之一電子分析天平（上海天平儀器廠）；KWY-101型電熱干燥箱（武漢市武昌實驗儀器廠）。

2方法與結(jié)果

2.1樣品的采集

2014年2月于牛頭山森林公園老虎寨，海拔582.10米處采集花期全草。采集當(dāng)天分別洗凈，置于50℃恒溫箱中干燥36 h，按全草、莖、葉、花不同部位分類，分別粉碎，過四號篩，備用。

2.2色譜條件[3]

色譜柱：Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相（甲醇-0.02％磷酸水溶液，20∶80）；流速1.00 mL/min；檢測波長325 nm；柱溫為40℃，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算均不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1　中華蛇根草不同組織HPLC圖譜

2.3供試品溶液的制備

取樣品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min（超聲功率500W），放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含42.5 μg的溶液，即得綠原酸對照品溶液。

2.5線性關(guān)系考察

分別取適量的綠原酸對照品，精密稱定，加甲醇溶解并添加至刻度，搖勻，以甲醇逐級稀釋，分別得到質(zhì)量濃度為170.00、85.00、42.50、21.25、10.63、5.31、2.66 μg/mL綠原酸對照品溶液，進樣10 μL。以進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為：

綠原酸的進樣量在0.027～1.700 μg之間呈線性關(guān)系。

2.6精密度試驗

取中華蛇根草全草，同“2.3”項下方法，制備供試品溶液，精密吸取10 μL，連續(xù)進樣6次，同法測定，計算RSD 0.35％，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取中華蛇根草全草，同“2.3”項下方法制備供試品溶液，同“2.2”項法測定，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定峰面積，計算RSD 0.47％，表明綠原酸在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗

取中華蛇根草全草6份，制備供試品溶液，測定，結(jié)果顯示綠原酸峰面積的RSD 0.69％，方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收試驗

采用加樣回收法，精密稱取中華蛇根草全草6份，每份約0.1 g，精密加入0.90 mg綠原酸，同“2.3”項方法制備供試品溶液，測定綠原酸的含量，結(jié)果表明該方法回收率良好，結(jié)果見表1。

表1　綠原酸的加樣回收率實驗結(jié)果?。╪=6）

2.10樣品中綠原酸的含量測定

取不同組織器官中華蛇根草樣品，按照供試品溶液制備方法進行處理，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣分析，結(jié)果見表2。

表2　2月中華蛇根草不同組織器官綠原酸含量　（±s，n=6）

表2　2月中華蛇根草不同組織器官綠原酸含量?。ā纒，n=6）

部位莖葉花全草綠原酸含量（mg/g）3.39±0.01 0.77±0.01 22.79±0.06 8.82±0.03

3討論

綠原酸具有清除自由基、抗菌消炎[4]、抗病毒、降糖、降脂、保肝利膽、保腎[5]等多種功效。近年來發(fā)現(xiàn)綠原酸類物質(zhì)有抗癌[6]、抗艾滋病的作用，可作為先導(dǎo)設(shè)計開發(fā)抗癌、抗艾滋病藥物。綠原酸作為葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，可以啟動中性粒細胞及前髓細胞HL-60的程序性細胞死亡，抑制人Hep3B肝癌細胞的金屬硫蛋（(MMP)分泌，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移。因此，綠原酸對腫瘤具有化學(xué)預(yù)防作用。有研究表明，綠原酸能通過增強S-腺苷-L-高氨酸的合成來抑制DNA甲基化，從而阻止癌細胞基因啟動子的轉(zhuǎn)錄[7]。

由上述測定結(jié)果可知，中華蛇根草不同組織器官中綠原酸的含量依次為花＞莖＞葉。因此，利用中華蛇根草中綠原酸的藥理作用在臨床用于抗菌、消炎、解毒、清除氧自由基和抗癌的治療時，選擇花較合適。

此外，其花中綠原酸的含量為22.79 mg/g，含量較高，由此，可以推測中華蛇根草具有清除自由基、抗菌、抗病毒、降糖、降脂或抗腫瘤等功效，但是目前未見中華蛇根草臨床應(yīng)用和藥理藥效的研究報道，其富含綠原酸是否與其藥效有關(guān)聯(lián)，還需相應(yīng)的臨床觀察及藥效試驗來佐證，本研究為野生中華蛇根草資源的充分利用，明確其藥用價值提供了理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] Wang W, Lu Y, Li L, et al. Distribution of anticancer drug in Ophiorrhiza japonica [J]. Joumal of Shanghai Normal University (Natural Sciences), 2009, 38 (1):59-62.

[2]張婷,美爾哈巴·熱西提,林瀟,等.HPLC-MS/MS法測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷[J].中草藥,2012,43(4):711-713.

[3]王華，蔡萍，萬丹，等.雙黃花片HPLC指紋圖譜的研究及其綠原酸和黃苓苷含量測定[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，32 （7）：41-44.

[4] Wang LJ, Li JH, Gao JJ, et al. Inhibitory effect of chlorogenic acid on fruit russeting in‘Golden Delicious’apple[J]. Scientia Horticulturae, 2014,178:14-22.

[5] Robert D, Olga C, Vesna S, et al. Renoprotective mechanisms of chlorogenic acid in cisplatin-induced kidney injury [J]. Toxicology,2014,324:98-107.

[6] Luciana GN, Maria V, Meritxell RF, et al. Promising antioxidant and anticancer (human breast cancer) oxidovanadium(IV) complex of chlorogenic acid. Synthesis, characterization and spectroscopic examination on the transport mechanism with bovine serum albumin[J]. Journal of Inorganic Biochemistry,2014,135:86-99.

[7]陳紹華,王亞琴,羅立新.天然產(chǎn)物綠原酸的研究進展[J].食品科技, 2008(2):195-198.

（本文編輯蘇維）

Comparative Study on the Content of Chlorogenic Acid in Ophiorrhiza chinensis from Different Organs

SHI Jinmin1, XU Mengfei2, ZHOU Can1, ZOU Qingwei1, ZHANG Xiaoyan1*
(1. Department of Pharmacy, Renmin Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan, HuBei 442000, China; 2. Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan, HuBei 430000, China)

Abstract〔〕Objective To determine the content of chlorogenic acid in different organs of Ophiorrhiza chinensis. Methods The contents of chlorogenic acid was determined with chromatographic column Inertsil C(18), And its mobile phase was methanol: 0.02％ phosphoric acid solution (20:80), the flow rate was 1.0 mL/min, detection wavelength was 325 nm and the column temperature was 40℃. Results There was a good linear relationship of chlorogenic acid between 0.027 and 1.700 μg (r=0.999 9). The content of chlorogenic acid of Japanese snakeroot which were harvested during February flowering period, in stems, leaves, flowers were 3.39, 0.77, 22.79 mg/g, respectively. Conclusion The contents of chlorogenic acid, which are also different in different organs of the Ophiorrhiza chinensis, the highest of which is the flower. The method is accurate and quick in qualitative identification and quantitative assay, which can be used for the quality control of Ophiorrhiza Chinensis.

Keywords〔〕HPLC; Ophiorrhiza chinensis; chlorogenic acid

〔通訊作者〕*張曉燕，女，主任藥師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：coarff66@126.com。

〔作者簡介〕石金敏，女，碩士，藥師，研究方向：天然藥物化學(xué)。

〔基金項目〕湖北省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計劃“武當(dāng)山區(qū)道地藥材產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)湖北協(xié)同創(chuàng)新中心”鄂教科函[2012]56號。

〔收稿日期〕2015-09-09

〔中圖分類號〕R284.1

〔文獻標(biāo)識碼〕B

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.007