富血小板血漿對人脂肪來源干細(xì)胞增殖率的影響

梁茜　潘福強(qiáng)　梁羽冰　黎凍

[摘要]目的：探討不同比例富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）對人脂肪來源干細(xì)胞（adipose-derived stemcells，ADSCs）的增殖及周期蛋白Cyclin D₁表達(dá)的影響。方法：分離培養(yǎng)ADSCs細(xì)胞，傳代至第3代，流式細(xì)胞儀鑒定。全血中分離PRP。采用隨機(jī)數(shù)字表法將將細(xì)胞分為4組（n=24）：C組不做任何處理，PRP₁₀組、PRP₂₀組和PRP₃₀組在ADSCs中加入PRP使其容積比分別為10%、20%和30%，于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖率，蛋白免疫印跡法（Western blot）測細(xì)胞周期蛋白Cyclin D₁的表達(dá)。結(jié)果：與C組比較，PRP₁₀組、PRP₂₀組、PRP₃₀組ADSCs細(xì)胞增殖率及Cyclin D₁蛋白的表達(dá)明顯增高（P<0.05）；組間比較PRP₃₀組ADSCs細(xì)胞增殖率及cyclin D₁蛋白的表達(dá)高于PRP₁₀組和PRP₂₀組（P<0.05）。結(jié)論：PRP以濃度依賴性方式促進(jìn)ADSCs細(xì)胞內(nèi)周期蛋白Cyclin D₁的表達(dá)，從而促進(jìn)ADSCs的增殖。

[關(guān)鍵詞]脂肪移植；脂肪來源干細(xì)胞；細(xì)胞增殖率；富血小板血漿；Cyclin D₁蛋白

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）03-0036-03

臨床上常因畸形、外傷、術(shù)后及美容等的需要而行軟組織缺損修復(fù)術(shù)。目前常用的移植填充材料主要有人工材料和自體組織。由于人工材料移植后可能出現(xiàn)排除反應(yīng)、感染及移位等并發(fā)癥，在臨床使用中受限。人體自身脂肪組織移植可避免上述并發(fā)癥，因其來源豐富，抽取脂肪后供區(qū)無明顯并發(fā)癥，理論上為最理想的填充材料。然而目前自體脂肪移植面臨最大的問題為移植后易被吸收，遠(yuǎn)期成活率較低。研究報(bào)道脂肪細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后能獲得穩(wěn)定生長、增殖能力強(qiáng)，且具備定向分化的干細(xì)胞。ADSCs作為可大量增殖的主要干細(xì)胞群，成為近年來脂肪移植研究的熱點(diǎn)。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）為自體血小板的濃縮體，內(nèi)含高濃度生長因子，包括PDGF、TGF-B、VEGF、b-FGF、IGF-1等。有研究報(bào)道富血小板血漿聯(lián)合脂肪來源干細(xì)胞移植能顯著提高脂肪移植成功率。但具體的機(jī)制尚未完全清楚，本研究擬通過不同體積比例的富血小板血漿對脂肪來源干細(xì)胞增殖及周期蛋白CyclinD1表達(dá)的影響，探討其可能機(jī)制，為臨床提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 取材

脂肪組織來源干細(xì)胞及富血小板血漿來自廣西醫(yī)科大學(xué)一附院美容整形外科接受脂肪抽脂術(shù)的女性患者1例，年齡28歲，排除糖尿病、冠心病、高血壓及其他傳染病患者。手術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清均購于Gibco公司；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、MTT購于Sigma公司；流式細(xì)胞試劑盒購自南京凱基生物公司；CyclinD1抗體、β-actin抗體購自CST公司。

1.3 細(xì)胞的分離培養(yǎng)

注射器負(fù)壓抽吸法抽取患者大腿后側(cè)脂肪組織，加入0.1%膠原酶Ⅰ，37℃水浴箱消化30min；加入含血清的種板培養(yǎng)基（90%DME-F12，10%胎牛血清，0.2mol/lL谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素）終止消化，1000rpm離心5min；棄上清，加入0.075mmol/l氯化鉀，靜置10min后離心棄上清，加入10%含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，移入培養(yǎng)皿。于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后隔天更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，用0.25%的胰酶消化，按1：3的比例進(jìn)行傳代。

1.4 流式細(xì)胞儀鑒定脂肪來源干細(xì)胞

將傳代到第3代的ADSCs用0.25%的胰酶消化10min，將消化液收集到離心管中，加入培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5min；棄上清，用D-Hanks沖洗重懸細(xì)胞，再次1000rpm離心5min；棄上清。D-Hanks將細(xì)胞重懸使細(xì)胞濃度約為1×10⁶/ml，同時(shí)設(shè)置陰性對照和同型對照。按照說明書加入CD45-PE，CD90-PE，CD106-PE單克隆抗體，4℃避光孵育30min離心，1000rpm離心5min；棄上清。PBS漂洗3次，加入200μl的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析標(biāo)記細(xì)胞。

1.5 富血小板血漿（PRP）提取及血小板計(jì)數(shù)

抽取患者約35ml外周血液，充分混勻，取0.5ml行全血PLT計(jì)數(shù)，余血液分裝至離心管，每管10ml：無菌條件下離心，4℃，l700rpm離心5min，管內(nèi)液體分為上層清液和紅細(xì)胞層，吸取全部上清至另一離心管；4℃，3200rpm離心5min，管內(nèi)液體上層為淡黃色貧血小板血漿，離心管底部黃褐色層為濃縮血小板，棄去約3/4上清液，剩余液體混勻即為PRP，對其行PLT計(jì)數(shù)。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)PRP容積比例不同將實(shí)驗(yàn)分為對照組（C組）、PRP₁₀組、PRP₂₀組、PRP₃₀組；C組不做任何處理，PRP₁₀、PRP₂₀組、PRP₃₀組在ADSCs中分別加入PRP使其容積比為10%、20%和30%，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 MTT法測細(xì)胞活力

將細(xì)胞以1×10⁶/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，200μ1/孔，每組36孔，分別加入不同體積的PRP孵育，同時(shí)設(shè)空白對照組，分12h、24h、36h、48h、60h、72h六個(gè)時(shí)段觀測；

到達(dá)觀測時(shí)段時(shí)，每組取6孔，每孔加入MTT液20μl，37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h；棄培養(yǎng)液，各孔加200μl二甲基亞砜，振蕩10min；用酶聯(lián)儀在490nm波長下檢測每孔的吸光值（OD），測定細(xì)胞活力，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率的計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖率（%）=OD_PRP組/OD_對照×100%。

1.8 Westernb lot法檢測Cyclin D₁蛋白的表達(dá)

用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行細(xì)胞蛋白含量測定。取50μg蛋白在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜，5%脫脂奶37℃封閉1h，加入Cyclin D₁抗體（1：1000，CST公司，美國）于4℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1：6000，Santa Cruz公司，美國），常溫孵育30min，曝光成像。以β-actin為內(nèi)參。應(yīng)用Quantity One5.0軟件（Bio-Rad公司，美國）進(jìn)行分析，以Cyclin D₁條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映Cyclin D₁蛋白的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)至第3代的ADSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD45和CD106呈陰性表達(dá)，CD90呈陽性表達(dá)（見圖1）。

2.2 富血小板血漿（PRP）提取實(shí)驗(yàn)

全血血小板濃度約為2.68×10³/μl，二次離心法得到的PRP中血小板的濃度約為40.2×10⁴/μ1。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)

與C組比較，PRP₁₀組、PRP₂₀組、PRP₃₀組ADSCs細(xì)胞增殖率和Cyclin D₁蛋白的表達(dá)明顯增高（P<0.05）；組間比較PRP₃₀組ADSCs細(xì)胞增殖率和Cyclin D₁蛋白的表達(dá)明顯高于PRP₁₀組和PRP₂₀組（P<0.05）（見表1，表2，圖2，圖3）。

3 討論

自體脂肪移植面臨的最大挑戰(zhàn)是如何提高移植后脂肪細(xì)胞的存活率。ADSCs作為脂肪組織中可大量增殖的干細(xì)胞群中的主要成分，不僅成為組織工程的理想種子細(xì)胞，在自體脂肪移植的整個(gè)過程中也發(fā)揮著重大作用。研究報(bào)道，ADSCs在缺血或者生長因子刺激的條件下釋放促血管化因子，且可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，目前ADSCs被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞和血管細(xì)胞的雙重前體細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)自人類脂肪組織取材，通過膠原酶消后培養(yǎng)經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定為ADSCs細(xì)胞，該方法具有產(chǎn)量豐富、獲取過程簡單、對人體創(chuàng)傷小等優(yōu)勢。

MTT法又稱四唑鹽法，經(jīng)線粒體琥珀酸脫氫酶裂解后生成紫藍(lán)色結(jié)晶，紫藍(lán)色結(jié)晶的生成量與細(xì)胞釋放出的酶活性成正比，而酶的活性與細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞活力成正比，因而可利用該方法間接反應(yīng)ADSCs細(xì)胞的活力及增殖率。本研究結(jié)果提示PRP以濃度依賴性方式促進(jìn)ADSCs增殖。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從上一次分裂結(jié)束到下一次分裂完成所經(jīng)歷的過程，是細(xì)胞生命活動(dòng)中一個(gè)最重要的過程。而細(xì)胞周期的有序性驅(qū)動(dòng)主要依賴于CDKs（cyclindependent-kinase，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶）為核心的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，其中Cyclin D₁蛋白是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，對決定細(xì)胞是否進(jìn)而分裂至關(guān)重要。研究報(bào)道細(xì)胞內(nèi)外的各種生長因子及有絲分裂的信號(hào)通過作用于可分裂細(xì)胞內(nèi)的Cyclin D₁，使其表達(dá)上升從而促使細(xì)胞進(jìn)入分裂期。

本研究結(jié)果表明PRP以濃度依賴性的方式提高ADSCs細(xì)胞活力及增值率，同時(shí)ADSCs細(xì)胞Cyclin D₁蛋白表達(dá)增加，提示PRP通過促進(jìn)ADSCs細(xì)胞增殖的機(jī)制與促進(jìn)Cyclin D₁蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

總之，PRP以濃度依賴性方式促進(jìn)ADSCs細(xì)胞Cyclin D₁蛋白的表達(dá)，提高ADSCs細(xì)胞增殖率。

編輯/張惠娟