自發(fā)性癲癇大鼠皮質和海馬中GLT-1、EAAC-1表達

鄒顯巍，劉愛東，余建萍

自發(fā)性癲癇大鼠皮質和海馬中GLT-1、EAAC-1表達

鄒顯巍，劉愛東，余建萍

目的：研究自發(fā)性癲癇大鼠皮質、海馬中谷氨酸轉運體-1（GLT-1）、興奮性氨基酸載體-1（EAAC-1）的轉錄、表達水平及其意義。方法：選取自發(fā)性癲癇Wistar大鼠（癲癇組）和正常Wistar大鼠（正常組）各10只，采用反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術檢測2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC1 mRNA轉錄水平，采用蛋白質印跡技術檢測2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1蛋白的表達水平。結果：癲癇組大鼠皮質中EAAC-1 mRNA相對灰度值為（0.67±0.21），明顯低于正常組大鼠的（1.54±0.38）（P＜0.01）；2組大鼠皮質中GLT-1 mRNA和海馬中GLT-1 mRNA、EAAC-1 mRNA相對灰度值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。癲癇組大鼠皮質中EAAC-1、GLT-1蛋白表達水平的相對灰度值分別為（72.6±8.7）和（103.7±12.6），顯著低于正常組大鼠的（116.5±15.1）和（139.5±14.2）（P＜0.01）；癲癇組大鼠海馬中GLT-1蛋白表達水平的相對灰度值（196.7± 23.5）明顯的高于正常組大鼠的（145.5±19.7）（P＜0.01）；2組大鼠海馬中EAAC-1蛋白表達水平的相對灰度值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：自發(fā)性癲癇大鼠皮質中GLT-1、EAAC-1表達水平下調可能與癲癇發(fā)生有關。

自發(fā)性癲癇大鼠；皮質；海馬；谷氨酸轉運體-1；興奮性氨基酸載體-1

癲癇是大腦神經(jīng)元異常放電引起大腦功能短暫失常的慢性腦部疾病[1]，其發(fā)作機制復雜多變，主要包括遺傳因素、腦部疾病等。有研究報道約42%的患者是遺傳因素導致癲癇發(fā)作[2]。在遺傳因素中，谷氨酸和其他氨基酸轉運功能的改變是其中重要的方面[3]。本文主要研究自發(fā)性癲癇大鼠皮質、海馬中谷氨酸轉運體-1（glutamate transporter-1，GLT-1）、興奮性氨基酸載體-1（excitatory amino-acid carrier 1，EAAC-1）的表達水平及其意義，探討其在代謝遺傳性癲癇的發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取選取自發(fā)性癲癇Wistar大鼠（癲癇組）和正常Wistar大鼠（正常組）各10只，雌雄各半，周齡11～13周，平均（12.3±0.4）周，體質量 260～320g，平均（289.4±18.6）g，自發(fā)性癲癇大鼠購買自中國醫(yī)科大學動物試驗部（合格證號2014009），所有大鼠生活在光照12 h、濕度40%～60%、溫度23℃～25℃的環(huán)境中，自由進食進水。

1.1.2 主要試劑與材料 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、EAAC-1、GLT-1引物均由TaKaRa公司合成；免疫組化SP試劑盒，DAB顯色試劑盒購于美國Santa Cruz公司；兔抗鼠EAAC-l、β-actin、GLT-1多克隆抗體購于美國Abcam公司；GDS-8000型凝膠成像系統(tǒng)購于德國Eppendoff公司；DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀購于山東六一儀器；PCR擴增儀購于美國Amersham Bioseiences公司；垂直電泳、印跡系統(tǒng)購于美國Biometra公司；低溫高速離心機購于英國UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測2組大鼠（正常組為4只大鼠，癲癇組為5只大鼠）皮質、海馬中GLT-1、EAAC1 mRNA轉錄水平。RNA提?。郝樽頎顟B(tài)下將大鼠斷頭，取出雙側皮質和海馬，使用TaKaRa RT-PCR試劑盒提取皮質和海馬的總RNA。RT反應體系：37°C 1.5 h，94°C 5～10 min，反應體積為10 μL。PCR反應體系：94°C預變性2 min，94°C 45 s，55°C 40 s，72°C 1 min，共30個循環(huán)，72°C延伸10 min，反應體積為50 μL，設空白對照。反應產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，測定灰度值[4]。

1.2.2 Western blotting 檢測2組大鼠（2組各3只大鼠）皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1蛋白的表達水平。蛋白樣品收集：大鼠麻醉狀態(tài)下斷頭迅速取皮質和海馬，加l mL裂解液，勻漿后4℃條件下12 000 g離心40 min，傾倒上清液，加入0.5 mL loading buffer，直接上樣。電泳：所有蛋白樣品調至等濃度后上樣電泳（10%SDSPAGE凝膠），電壓120 V。轉膜：將PVDF膜在M-OH中浸泡20 min以上，之后將PVDF膜并濾紙轉入轉移液中。封閉及雜交：將膜取出，用去離子水與TTBS稍加漂洗，在含5%脫脂奶粉的TTBS封閉液與抗體溶劑中室溫封閉1.5 h，加入一抗（1∶600）室溫下3 h，再用TTBS漂洗膜后再浸洗3次，最后加入相應的二抗（1∶5 000）室溫下2 h，再用TTBS漂洗膜后再浸洗3次。發(fā)光鑒定：ECL化學發(fā)光法顯色，結果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，測定灰度值[5]。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1 mRNA轉錄水平比較

癲癇組大鼠皮質中EAAC-1 mRNA相對灰度值為（0.67±0.21），明顯低于正常組大鼠的（1.54±0.38），有顯著性差異（P＜0.01）；2組大鼠皮質中GLT-1 mRNA的轉錄水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1、圖1。2組大鼠海馬中GLT-1 mRNA、EAAC-1 mRNA相對灰度值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1 mRNA相對灰度值比較（）

表1 2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1 mRNA相對灰度值比較（）

組別 只數(shù) 皮質GLT-1EAAC-1海馬GLT-1EAAC-1正常組癲癇組t值P值10 10 1.20±0.33 1.14±0.28 0.438 0.718 1.54±0.38 0.67±0.21 6.337＜0.001 1.10±0.26 1.03±0.25 0.614 0.539 1.27±0.34 1.22±0.29 0.354 0.796

圖1 RT-PCR法檢測2組大鼠皮質EAAC-1 mRNA轉錄水平

2.2 2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1蛋白表達水平比較

Western blotting檢測結果顯示，癲癇組大鼠皮質中EAAC-1、GLT-1蛋白表達水平的相對灰度值分別為（72.6±8.7）及（103.7±12.6），明顯低于正常組大鼠的（116.5±15.1）及（139.5±14.2），有顯著性差異（P＜0.01）；癲癇組大鼠海馬中GLT-1蛋白表達水平的相對灰度值（196.7±23.5），明顯高于正常組大鼠的（145.5±19.7），有顯著性差異（P＜0.01）；2組大鼠海馬中EAAC-1蛋白表達水平的相對灰度值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2、圖2。

3 討論

癲癇長時間頻繁的發(fā)作會對患者身心各方面造成嚴重影響[6]，其發(fā)病機制尚不完全清楚，部分分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn)遺傳性癲癇的分子機制為離子通道或相關分子的結構或功能改變[7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，多種癲癇動物模型和癲癇患者的腦組織突觸間隙內谷氨酸濃度明顯增加[8,9]。谷氨酸是腦內最重要的興奮性氨基酸，谷氨酸轉運體能將谷氨酸從突觸間隙清除，且具有唯一性。谷氨酸轉運體包括GLT-1、EAAC-l等。GLT-1為膠質細胞型轉運體，EAAC-l為神經(jīng)元型轉運體，前者在大腦皮質和海馬中表達最為豐富，能吸收超過90%的谷氨酸；后者主要在各腦區(qū)的神經(jīng)元中表達，能降低突觸間隙谷氨酸濃度[10]。研究發(fā)現(xiàn)若小鼠敲除GLT-1基因會發(fā)生致命性自發(fā)性癲癇[11]，成年大鼠海馬EAAC-l被反義下調時會表現(xiàn)出與癲癇小發(fā)作相似的現(xiàn)象，但具體原因還需進一步探究。因此本課題主要研究了自發(fā)性癲癇大鼠皮質、海馬中GLT-1和EAAC-1的轉錄、表達水平及其意義。

表2 2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1蛋白表達水平相對灰度值比較（）

表2 2組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1蛋白表達水平相對灰度值比較（）

組別只數(shù)正常組癲癇組t值P值10 10皮質GLT-1 139.5±14.2 103.7±12.6 5.963＜0.001 EAAC-1 116.5±15.1 72.6±8.7 6.913＜0.001海馬GLT-1 145.5±19.7 196.7±23.5 5.280＜0.001 EAAC-1 164.0±19.8 169.3±21.5 1.006 0.251

圖2 2組皮質（A）及海馬（B）中GLT-1、EAAC-1蛋白表達水平的Western blotting檢測結果

本實驗通過對癲癇組大鼠與正常組大鼠皮質、海馬中GLT-1、EAAC-1 mRNA和蛋白的轉錄、表達水平進行比較，結果顯示，皮質中EAAC-1 mRNA和EAAC-1蛋白表達水平均顯著下調，轉錄和翻譯有很好的相關性，與其他相關研究結果類似[12]。推測可能是EAAC-l表達下調打破抑制性和興奮性氨基酸系統(tǒng)之間的平衡，促進癲癇發(fā)生。本研究顯示海馬中GLT-1 mRNA轉錄水平?jīng)]有改變，但GLT-1蛋白表達顯著上調。

綜上所述，該遺傳性癲癇模型的發(fā)病機制之一可能與皮質中EAAC-1、GLT-1 mRNA和蛋白表達下調有關。而致使分子學機制異常的根本原因以及能否利對谷氨酸轉運體的藥物以達到治療癲癇一步研究。

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（本文編輯：唐穎馨）

Expression of EAAC-1 and GLT-1 in Cortex and Hippocampus of Rats with Spontaneous Epi-lepsy

ZOU Xian-wei,LIU Ai-dong,YU Jian-ping.Department of Internal Medicine-Neurology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500,China

Objective:To investigate the expression of glutamate transporter-1(GLT-1)and excitatory amino acid transporter-1(EAAC-1)in cortex and hippocampus of spontaneous epileptic rats.Methods:Wistar rats were divided into epilepsy group and normal group with 10 rats in each group.The transcription levels of GLT-1 and EAAC-1 mRNA in cortex and hippocampus were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The expression levels of EAAC-1 and GLT-1 protein was detected by Western blot analysis.Results: The transcription level of EAAC-1 mRNA in cortex of epilepsy group was(0.67±0.21),which was significantly lower than that of control group(P＜0.05).No difference was observed in the transcription level of GLT-1 mRNA in cortex and the levels of GLT-1 mRNA and EAAC-1 mRNA in hippocampus between 2 groups(P＞0.05).The expression levels of EAAC-1 and GLT-1 protein in cortex of epilepsy group were(72.6±8.7)and(103.7±12.6), which were significantly lower than those in control group(P＜0.01).The expression level of GLT-1 protein in hippocampus of epilepsy group was(196.7±23.5),which was significantly higher than that of control group(P＜0.01).No difference was shown in the transcription levels of EAAC-1 protein in hippocampus between 2 groups (P＞0.05).Conclusion:The down-regulation of GLT-1 and EAAC-1 expression in cortex may be involved in the occurrence of epilepsy in rats with spontaneous seizures.

spontaneous epileptic rat;cortex;hippocampus;glutamate transporter-1;excitatory amino acid car-

R741;R742.1

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.003

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科成都 610500

2015-10-16

鄒顯巍3188902437@qq. com