大鼠面神經(jīng)損傷修復晚期面神經(jīng)核的基因表達譜

陳沛，宋俊，李春麗，張鄂，羅凌惠，肖紅俊，龔樹生

大鼠面神經(jīng)損傷修復晚期面神經(jīng)核的基因表達譜

陳沛1，宋俊2，李春麗1，張鄂1，羅凌惠3，肖紅俊3，龔樹生4

目的：篩選外周損傷修復晚期面神經(jīng)核區(qū)的差異表達基因。方法：建立大鼠面神經(jīng)斷傷吻合模型，90 d后準確解剖定位獲取健患兩側面神經(jīng)核組織的總RNA，再以其逆轉錄的cDNA為模板轉錄生成生物素標記的cRNA，純化與片段化后形成探針并與大鼠基因表達譜芯片雜交，掃描儀檢測信號后用生物學分析軟件篩選差異表達基因并作初步功能分析。結果：基因芯片檢測表明，患側面神經(jīng)核區(qū)檢出1 660個基因，健側檢出1 683個基因，與健側相比篩選出差異基因300個，其中上調157個（差異倍數(shù)≥2），下調143個（差異倍數(shù)≤-2）。GO分析電子功能注釋發(fā)現(xiàn)，差異基因功能涉及代謝反應、細胞黏附、細胞因子、信號傳遞等。KEGG信號通路分析篩選出最可能相關的信號通路32個（P＜0.05），包括白細胞跨膜轉運、黏著斑激酶途徑等。結論：基因表達譜分析表明多基因、多信號通路參與外周損傷修復晚期面神經(jīng)核內的塑形活動。

損傷修復；面神經(jīng)核；基因芯片

外傷、手術、炎癥或腫瘤均可引起面神經(jīng)損傷而導致面癱，修復治療后也常伴發(fā)鱷魚淚、聯(lián)帶運動、面肌痙攣等面癱后遺癥，所造成的容貌損害及功能障礙嚴重影響患者的生活、工作、社交與心理健康。面運動神經(jīng)元接受、傳導和整合運動信息，決定著面神經(jīng)損傷后的變性過程與再生質量[1,2]。研究表明，外周損傷后面運動神經(jīng)元周圍的突觸傳入、神經(jīng)遞質調控、免疫反應與膠質活動均發(fā)生塑形改變[3-6]。雖然一系列與神經(jīng)元軸突再生相關的基因被研究發(fā)現(xiàn)[7-11]，但面神經(jīng)核內的傷后復雜的塑形活動涉及多個途徑、多基因改變，目前的研究卻多著眼于外周損傷后一些基因的短期變化，缺乏對損傷修復晚期面神經(jīng)核內基因表達譜變化的全面分析?；蛐酒瑢鹘y(tǒng)分子生物學方法與芯片技術結合，可在較短時間內對大量基因進行檢測，故可對較復雜、多因素的病理生理過程導致的大量基因表達異常進行分析，為研究者提供一個較全面、無偏倚的判斷[12,13]。

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠面神經(jīng)斷傷修復2月后，無論行為學與肌電活動均檢測到聯(lián)帶運動[14]。因此，本研究建立大鼠面神經(jīng)斷傷吻合模型，獲取傷后晚期健患兩側的面神經(jīng)核組織，應用基因芯片技術篩選出差異表達基因，通過分子生物學數(shù)據(jù)分析，尋找可能與神經(jīng)再生修復和后遺癥產(chǎn)生有關的信號分子及信號路徑，為進行相關深入研究提供有價值的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雌性成年大鼠6只，體質量200～220 g。

1.1.2 主要試劑與儀器 Leica VT1200振動切片機（購于德國Leica公司）。Rat Genome 230 2.0 Array基因表達譜芯片（購于美國Affymetrix公司）；在線分子注釋系統(tǒng)（Molecule Annotation System，MAS 2.0，購于北京博奧生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 取6只大鼠，常規(guī)10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后于無菌條件下暴露左側莖乳孔外面神經(jīng)主干，斜行切斷后用11-0無創(chuàng)縫線斷端縫合神經(jīng)外膜兩針，逐層縫合肌肉皮膚，同法處理右側，但僅暴露面神經(jīng)主干。麻醉蘇醒后，觀察到大鼠左側觸須失去拂動能力，鼻尖偏向健側，眼瞼下垂，同時左側觸須出現(xiàn)細微纖顫，常伴嗤鼻動作，提示面癱模型建立成功[6,14]。

1.2.2 面神經(jīng)核組織RNA獲取 大鼠飼養(yǎng)至術后90 d時，麻醉后斷頸取腦并迅速于冰上切取腦干組織，行振動切片機切片，層厚100 μmol/L，至接近腦干腹側出面神經(jīng)根處時腦片行1%甲苯胺藍快速染色1 min，顯微鏡下觀察確認為含面神經(jīng)根層面后，調整片厚為500 μmol/L，切1片棄去后留取第2片腦片待用，重新調整片厚至100 μmol/L，待切取腦片行快速甲苯胺藍染色確認所獲取的500 μmol/L腦片為含面神經(jīng)核團組織后，在該腦片上切取距中線1.5 mm、距腹側水平線1 mm面核區(qū)內約1.5×1.5 mm大小組織；同法取健側面神經(jīng)核組織。利用Trizol試劑盒采用一步法分別提取實驗組與對照組面核腦組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA質量，1%瓊脂糖電泳鑒定總RNA完整性。

1.2.3 芯片檢測、數(shù)據(jù)處理和生物學信息分析 以RNA為模版，逆轉錄依次合成單鏈及雙鏈cDNA，雙鏈cDNA經(jīng)純化后體外轉錄合成生物素標記的cRNA，純化后再片段化形成探針。配制好基因芯片雜交液，將雜交液置于加熱塊上，99℃溫育5 min，預雜交后，將芯片平衡放置于雜交爐中，45℃下60 rpm旋轉雜交16 h。應用Affymetrix公司流式工作站450和掃描儀3 000進行芯片清洗染色和掃描。

用Gcos1.4軟件進行單張芯片信號值提取，和dChip 2006軟件中的不變集（invariant 8et）標準化方法對6張芯片的數(shù)據(jù)進行歸一化處理，按差異表達水平達2倍為顯著性標準篩選出表達差異的基因，利用在線分子注釋系統(tǒng)，對差異基因進行基因功能的分類注釋（gene ontology，GO）和信號通路分析（KEGG）。

2 結果

2.1 獲取面神經(jīng)核組織RNA

依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，在振動切片機切取含面神經(jīng)根層面100 μmol/L腦片后（圖1A-C），切取第2片500 μmol/L厚內含面神經(jīng)核組織的腦片，核團定位準確性由隨后所切取的100 μmol/L腦片快速甲苯胺藍染色證實（圖1D-F，圖1E內方框示具體取材部位)。健側面核區(qū)組織中提取總RNA為（18.5±1.6）μg，患側面核區(qū)組織中提取總RNA為（21.8±2.1）μg，健患兩側RNA的OD260/OD280比值在1.95～2.10之間。RNA樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度接近1∶1（圖2），RNA質量符合表達譜芯片實驗要求。

2.2 基因芯片檢測結果

基因芯片提供的2 800個基因中，患側檢出1 660個，健側檢出1 683個。按差異表達水平達2倍為顯著性標準，與健側芯片數(shù)據(jù)比較篩選出差異基因300個，其中上調157個（差異倍數(shù)≥2），下調143個（差異倍數(shù)≤-2）。GO分析電子功能注釋表明，表達上調基因功能涉及代謝反應、細胞黏附、細胞因子、信號傳遞等；表達下調基因功能涉及細胞因子、代謝、細胞粘附、信號傳遞等生物學過程（表1）。

對差異表達的基因進行KEGG信號通路分析，篩選出最可能相關的信號通路32個（P＜0.05），包括白細胞跨膜轉運、鐵離子通道結合、細胞因子活動、細胞粘附分子、損傷反應、磷脂酰信號系統(tǒng)、骨架分子活動、局部粘著、生物刺激反應等。其中表達上調的差異基因RGD1565941_predicted、絨毛蛋白2、claudin 1先后6次參與白細胞跨膜轉運途徑，另外3個表達上調的差異基因整合素β6、Pip5kia、類VAV3致癌基因則同時參與黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）途徑信號通路。

圖1 大鼠含面神經(jīng)根（A-C）與面神經(jīng)核腦片層面（D-F）

圖2 健患兩側面神經(jīng)核組織RNA電泳圖

3 討論

本研究提取大鼠健患兩側面神經(jīng)核區(qū)組織總RNA進行基因芯片檢測，所獲取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂凝膠電泳進行質檢證實合格。由此可見，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜解剖知識，采用振動切片結合快速甲苯胺藍尼染色方法，可以快速、準確地定位面神經(jīng)核區(qū)腦組織，從而獲得質量可靠的RNA用于下游檢測，為本領域及其它腦研究提供了技術參考。

本研究選用包含3 100個探針位點、代表2 800個功能明確的大鼠基因的cDNA基因表達譜芯片，經(jīng)檢測，得到外周損傷修復晚期大鼠面神經(jīng)核內較全面的基因表達變化信息，有助于推測該差異基因群與神經(jīng)損傷修復晚期塑形活動與后遺癥產(chǎn)生的可能聯(lián)系。利用MAS2.0系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，差異基因功能涉及白細胞跨膜轉運、鐵離子通道結合、細胞因子活動、細胞粘附分子、損傷反應、磷脂酰信號系統(tǒng)、骨架分子活動、局部粘著、生物刺激反應等，其中大部分尚未見涉及神經(jīng)損傷的詳細報道。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）通過和細胞膜上的特異性受體結合，促進細胞生長、分化、調亡及誘發(fā)炎癥等多種生物學效應，活躍地參與神經(jīng)損傷修復活動[15]。TNF超家族2的表達產(chǎn)物TNF-α可激活Caspase蛋白酶、JNK（Jun kinase）和轉錄因子NF-κB三條信號通路，其中NF-κB促進存活，而JNK加速細胞死亡，TNFa介導的JNK活化可加速NF-κB誘導的Caspase-8的抵制劑、抗調亡蛋白c-FLIP的逆轉[16]。有研究發(fā)現(xiàn)用TNF-α對人唾液腺（human salivary gland,HSG）細胞進行處理后，能促使Fas受體表達增加，激活Caspase-8進而誘導HSG細胞的凋亡[17]。以往研究表明，大鼠顳外段面神經(jīng)損傷后面運動神經(jīng)元未見明顯凋亡壞死[18,19]。本研究基因芯片檢測結果表明患側面核區(qū)細胞因子TNF在傷后表達下調，也再次間接支持凋亡并非外周損傷后面運動神經(jīng)元主要轉歸的觀點。

信號通路分析結果發(fā)現(xiàn)，差異基因整合素β6、Pip5kia、類VAV3致癌基因活躍地參與晚期神經(jīng)損傷修復活動中的FAK信號通路。細胞粘附分子整合素家族β1與β2于面神經(jīng)損傷后在面運動神經(jīng)元內高表達，可將外周軸突芽生的生長錐局限化[20]。整合素β1在細胞表面的成簇表達能夠使FAK在黏著斑部位快速集中并同時發(fā)生自身酪氨酸磷酸化，或通過與細胞外基質中的特殊氨基酸序列結合，從而激活下游的細胞遷移信號分子如細胞骨架蛋白等，引發(fā)細胞的變形、收縮、粘附和遷移[21,22]。推測整合素β6可與細胞外基質結合從而激活FAK信號途徑，調節(jié)肌動蛋白細胞骨架結構，進而影響細胞黏附、生長及遷移，通過影響晚期塑形活動而影響神經(jīng)元功能。

表1 差異基因的GO功能注釋結果

NM-012786細胞色素C氧化酶8B亞型2.90離子運輸NM-030838溶質載體有機陰離子轉運家族1a5水通道1脂聯(lián)素18.63 AA891661 BM386227核蛋白體BF419582 AI454360細胞因子NM-031530 8.47 2.16睪丸表達基因15乙二醛酶域5 2.39 2.57下調-2.35 NM-053960 -2.00 AA819227趨化因子(C-C基元)配體2趨化因子(C-C基元)受體5腫瘤壞死因子（TNF超家族2）-2.17代謝相關L21698 -3.07 AB052846信號傳遞AF041107 UDP半乳糖轉移酶8A甾醇C5-脫氫酶-3.83 -2.44 NM-017028 -2.30 X52711 -6.36 NM-033359細胞粘附NM-053457凝血相關NM-012532轉錄相關NM-053412 GTP酶激活Ran GAP域樣1粘病毒（流感病毒）抗性蛋白2粘病毒（流感病毒）抗性蛋白1神經(jīng)球蛋白-2.15 claudin 11 -3.00銅藍蛋白-2.11白介素結合增強因子-2.09內分泌AW524433類RIKEN cDNA 1110038F21 -2.14

神經(jīng)損傷修復涉及多種靶分子和多條神經(jīng)信號通路，此基因表達譜芯片雖有高能量的優(yōu)勢，但仍只能著眼于浩大基因庫內的一小部分而制約了研究結果的科學價值，例如許多差異表達基因、信號通路在神經(jīng)損傷再生病理機制中的作用尚未明確，也還不清楚這些基因之間的調控關系和主次關系。若能采用更具體的功能分類基因芯片或定制芯片檢測并進行下游驗證，將更有助于從基因水平揭示其病理生理過程。

總之，面神經(jīng)損傷修復過程涉及多因素、多途徑的參與，應用基因芯片技術檢測傷后晚期面神經(jīng)核基因表達譜的變化，可為研究闡明面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核內塑形變化與面癱后遺癥的產(chǎn)生機制提供新思路。

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（本文編輯：王晶）

Late Gene Expression Profiles of Facial Nucleus in Rat Following Facial-facial Anastomosis

CHEN Pei1,SONG Jun2,LI Chun-li1,ZHANG E1,LUO Ling-hui3,XIAO Hong-jun3,GONG Shu-sheng4.1.Department of Otorhinolaryngology,Wuhan No.1 Hospital,Integrative Medicine Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;2.Department of Otorhinolaryngology, Wuxi Third People’s Hospital,Wuxi 214041,China;3.Department of Otorhinolaryngology,Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;4.Department of Otorhinolaryngology,Beijing Friendship Hospital,Capital University of Medical Science,Beijing 100050, China.

Objective:To determine the differentially expressed genes of facial nucleus at the late stage of peripheral injury.Methods:The model was set up by facial-facial anastomosis in left facial nerve of rats.Contralateral side was selected as control.At the 90 day post-surgery,the rats were killed.The total RNA of facial nuclei at both sides were extracted;cDNA were obtained from purified total RNA by reversed-transcription.Biotinlabeled cRNA was synthesized by transcription and then was fragmented and hybridized with gene expression profile chip.The gene chip was scanned with scanner.Differentially expressed genes were statistically analyzed for biological function by gene ontology(GO)classes and KEGG pathway.Results:The detection of gene chip showed that 1660 genes were in the facial nucleus of the injury side and 1683 genes were in the healthy side. Three hundreds genes in facial nucleus at injury side,including 157 upregulated genes(difference times≥2)and 143 downregulated genes(difference times≤-2),were shown in differentially expressed profiles as compared to the controls.The differentially expressed genes were classified into functional categories such as cytokines,immune response molecules,signal transduction molecules,ion deliver and cell adhesion molecules,etc by GO analysis.KEGG Pathway analysis screened 32 relevant signal pathways,including leukocyte transmembrane transport pathway and focal adhesion kinase(FAK)pathway(P＜0.05).Conclusion:Multiple genes and complicated signal pathways are involved in the plastic activity of facial nucleus at late stage of peripheral injury and regeneration.

R741;R745.1+2

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.002

1.武漢市第一醫(yī)院（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院）耳鼻咽喉頭頸外科武漢 430022

2.無錫市第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科江蘇 無錫 214008 3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科武漢 430022

4.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科北京 100050

國家自然科學基金（No.30600699, 30471879）

2015-11-07

陳沛chenpeioto@163. com