右美托咪定改善大鼠腦缺血再灌注后認(rèn)知功能障礙

畢江江，王金韜，羅愛林

·論著·

右美托咪定改善大鼠腦缺血再灌注后認(rèn)知功能障礙

畢江江，王金韜，羅愛林

目的：觀察右美托咪定（Dex）對(duì)大鼠腦缺血再灌注后認(rèn)知功能障礙的影響。方法：64只SD大鼠隨機(jī)分為MCAO組、假手術(shù)組、Dex組、對(duì)照組，每組16只。建立腦缺血模型，MCAO組大腦中動(dòng)脈阻塞60 min后再灌注，假手術(shù)組僅分離血管，Dex組術(shù)前腹腔注射Dex 100 μg/kg，其他組經(jīng)腹腔注射相同體積生理鹽水，對(duì)照組僅接受全麻20 min，不予手術(shù)處理。24 h后ELISA法測(cè)定各組大鼠額葉皮質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)。術(shù)后第7天開始Barnes迷宮測(cè)試觀察大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果：MCAO組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)比假手術(shù)組、對(duì)照組和Dex組均增高（均P＜0.05），Dex組的炎性因子表達(dá)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MCAO組大鼠在Barnes迷宮進(jìn)入目標(biāo)洞時(shí)間比假手術(shù)組、對(duì)照組和Dex組均延長(zhǎng)（均P＜0.05），Dex組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：Dex能降低大鼠腦缺血術(shù)后中樞神經(jīng)炎性因子的表達(dá)，改善其術(shù)后認(rèn)知功能障礙。

右美托咪啶；認(rèn)知功能障礙；缺血再灌注

缺血缺氧性腦病占所有腦血管疾病的2/3左右，腦缺血超過1 h，即出現(xiàn)不可逆性腦損傷，并出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、感覺及認(rèn)知障礙，目前缺乏確切的綜合治療手段。近年來，諸多研究表明右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用[1]。本實(shí)驗(yàn)觀察Dex應(yīng)用于大鼠腦缺血性損傷后認(rèn)知功能、神經(jīng)炎性因子表達(dá)的變化，為其可能的作用機(jī)制提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡雄性SD大鼠64只，體質(zhì)量300～400 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、MCAO組、Dex組各16只。

1.2 方法

術(shù)后24 h檢測(cè)炎性因子表達(dá)的大鼠共24只，每組6只；術(shù)后第7天進(jìn)行Barnes迷宮訓(xùn)練的大鼠共40只，每組10只。

1.2.1 麻醉及手術(shù)方法 大鼠吸入3%異氟醚，翻正反射消失、無疼痛反應(yīng)后氣管插管及機(jī)械通氣，吸入100%O2，呼吸參數(shù)為潮氣量2 mL，呼吸頻率65次/分，維持麻醉吸入2%異氟醚，監(jiān)測(cè)大鼠心率、脈氧飽和度。Dex組經(jīng)腹腔注射Dex 100 μg/kg，對(duì)照組、假手術(shù)組和MCAO組經(jīng)腹腔注射相同體積生理鹽水。大鼠仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，近心端結(jié)扎CCA、ECA，將拴線插入到ICA的深度為18 mm時(shí)結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端。整個(gè)麻醉及手術(shù)過程20 min，大鼠翻正反射恢復(fù)后拔管。缺血60 min后抽出拴線。假手術(shù)組在全麻下做頸正中切口，分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，不造成缺血，縫合切口后蘇醒。對(duì)照組予全麻20 min后蘇醒，無手術(shù)及藥物處理。

1.2.2 提取腦組織標(biāo)本 術(shù)后24 h，大鼠經(jīng)3%異氟醚吸入麻醉，翻正反射消失、無疼痛反應(yīng)后，用4℃生理鹽水心臟灌注5 min，迅速分離大腦額葉皮質(zhì)，每例標(biāo)本約重80 mg，-80℃保存。

1.2.3 ELISA法測(cè)定炎性因子 將大鼠額葉皮質(zhì)分別溶解于20 mmol/L的Tris-HCl（pH值7.4）中，每毫克腦組織使用5 μL裂解液。冰上充分研磨后超聲裂解，4℃下13 000 rpm離心25 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按照ELISA試劑盒說明書步驟測(cè)試IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平（ELISA試劑盒均購于英國(guó)Abcam公司）。ELISA測(cè)試結(jié)果與對(duì)應(yīng)蛋白濃度比值為炎性因子的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 Barnes迷宮測(cè)試 手術(shù)后第7天采用Barnes迷宮法觀察大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。將大鼠放在一個(gè)白色的圓形平臺(tái)上，平臺(tái)的邊緣均勻分布20個(gè)圓形小洞，只有其中一個(gè)洞與一個(gè)暗格相連，為目標(biāo)洞。將大鼠用避光的圓筒罩住，打開白熾燈直射平臺(tái)，10 s后移走圓筒，開啟85 dB的噪音，觀察大鼠在平臺(tái)上的運(yùn)動(dòng)軌跡。大鼠會(huì)隨機(jī)或有目的地探索平臺(tái)周邊的洞口，記錄大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞的時(shí)間。若3 min后仍不能找到目標(biāo)洞，則手動(dòng)把大鼠放入目標(biāo)洞，蓋上遮光板，關(guān)掉噪音，讓其在暗格里停留2 min。每只大鼠每天訓(xùn)練2次，一共訓(xùn)練4 d。自開始訓(xùn)練起第5天和第12天分別測(cè)試一次，記錄每只大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。行為學(xué)訓(xùn)練期結(jié)果采用雙向重復(fù)測(cè)量方差分析，其余結(jié)果組間比較采用單向方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組額葉皮質(zhì)炎性因子表達(dá)水平比較

腦缺血再灌注24 h后MCAO組大鼠皮質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)高于對(duì)照組、假手術(shù)組和Dex組（均P＜0.05）；Dex組大鼠皮質(zhì)炎性因子的表達(dá)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低于MCAO組（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注24 h后額葉皮質(zhì)IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）表達(dá)水平比較

2.2 各組大鼠Barnes迷宮測(cè)試結(jié)果比較

MCAO組進(jìn)入目標(biāo)洞時(shí)間較對(duì)照組、假手術(shù)組和Dex組延長(zhǎng)（均P＜0.05）；Dex組進(jìn)入目標(biāo)洞時(shí)間與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低于MCAO組（P＜0.05），見圖2。

3 討論

Dex是一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)藥，通過激動(dòng)突觸前膜α2腎上腺素受體，抑制去甲腎上腺素的釋放，起到抗焦慮、鎮(zhèn)靜的作用，同時(shí)阻斷疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)，其安全性和有效性使之成為一種嶄新的麻醉輔助用藥而廣泛應(yīng)用于臨床[2]。Dex主要作用于藍(lán)斑核，該部位主要負(fù)責(zé)覺醒、睡眠、焦慮和藥物成癮的戒斷癥狀[3]。因此，其鎮(zhèn)靜和抗焦慮等中樞作用與通過γ-氨基丁酸系統(tǒng)起作用的GABA類鎮(zhèn)靜藥不同，用藥后一般不產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙。α2受體激動(dòng)劑的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制還未完全闡明，目前的假說包括Dex可減少缺血引起的腎上腺素過度分泌，黏著斑激酶表達(dá)增加[4]，中樞性谷氨酸鹽釋放的調(diào)節(jié)，減少Ca2+進(jìn)入以及凋亡等[5]。Sato等[6]在麻醉后腦缺血大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，使用Dex能明顯改善大鼠腦缺血現(xiàn)象。Tanskanen等[7]及Engalhard等[8]發(fā)現(xiàn)Dex的作用呈劑量依賴性，在短暫性夾閉動(dòng)物大腦中動(dòng)脈過程中，大劑量組的腦梗死面積較中劑量和小劑量組少。

圖2 各組第5天（A）、第12天（B）Barnes迷宮測(cè)試結(jié)果比較

近年來，炎性反應(yīng)在腦缺血再灌注的過程中發(fā)揮的作用受到較多的關(guān)注。大量研究顯示腦缺血再灌注時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞可釋放大量炎性因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等[9]，同時(shí)激活免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的附著，促進(jìn)其他炎性因子的產(chǎn)生和釋放，激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)加重腦損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Dex組大鼠腦皮質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α含量均低于MCAO組，提示Dex可能抑制炎性細(xì)胞因子的生成，從而抑制炎癥反應(yīng)，減輕缺血再灌注損傷。Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)中Dex組大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞時(shí)間也少于MCAO組，提示該組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能優(yōu)于MCAO組，Dex可能改善腦缺血后認(rèn)知功能障礙。Dex對(duì)于腦缺血再灌注損傷的炎癥抑制作用是否呈劑量依賴性，以及其對(duì)人體神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：王晶）

Neuroprotective Effects of Dexmedetomidineto on Cognitive Dysfunction after Cerebral Isch-emia-reperfusion Injury in Rats

BI Jiang-jiang,WANG Jin-tao,LUO Ai-lin.
Department of Anesthesiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science&Technology,Wuhan 430030, China

Objective:To investigate the effect of dexmedetomidine(Dex)on cognitive dysfunction after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Methods:Forty-eight SD rats were randomly divided into groups of control,surgery and Dex,with 16 rats in each group.The surgery and Dex groups were subjected to middle cerebral artery occlusion(MCAO).The Dex group received Dex via intraperitoneal injection at a dose of 100 μg/kg before MCAO operation.The groups of surgery and control were given normal saline of same volume.The control group received 20 min’s anesthesia without surgery.The IL-1β,IL-6 and TNF-α levels in cerebral cortex were determined with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)at 24 hours after surgery.On day 7 after surgery,rats were assessed by Barnes maze test.Results:The IL-1β,IL-6 and TNF-α levels in the surgery group were significantly higher than those in the Dex and control groups(allP＜0.05).The latency to find the target box in the surgery group was much longer than that in the Dex treatment and control groups(allP＜0.05).Conclusion:Dex may decrease the expression of neuroinflammatory factors after cerebral ischemia in rats,and improve the cognitive function.

Dexmedetomidine;cognitive dysfunction;ischemia-reperfusion injury

R741;R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.001

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科

武漢 430030

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.30901390）

2016-01-24

羅愛林

alluo@tjh.tjmu.edu. cn