同時(shí)測定6種柿葉黃酮類物質(zhì)方法的建立

安淼 余賢美 王潔 劉加芬 艾呈祥

摘 要：為建立一種同時(shí)測定6種柿葉黃酮類物質(zhì)的方法，通過對液相色譜檢測波長、流動(dòng)相、柱溫等條件的探索，最終確定了蘆丁、山柰素、異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷和紫云英苷6種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜檢測條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇為流動(dòng)相A，以0.5%乙酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，0～100 min A∶B為20∶80，105 min后為40∶60；檢測波長為360 nm；柱溫為35℃；體積流量1.0 mL/min。并以兩個(gè)品種的柿葉為樣品，對所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證，得到了預(yù)期結(jié)果，說明建立的檢測方法是可行的。

關(guān)鍵詞：柿葉；黃酮類物質(zhì)；高效液相色譜；同時(shí)檢測

中圖分類號(hào)：S665.209.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）05-0131-06

Abstract The HPLC method for simultaneous detection of 6 flavonoids from persimmon leaves was established by exploring the detection conditions such as wavelength， mobile phase and column temperature. The 6 flavonoids were lutin， kaempferol， isorhamnetin， quercetin， isoquercitrin and astragalin. The results showed that the 6 flavonoid standards could be detected simultaneously under the following conditions： using C18 as stuffing bulking agent， carbinol as mobile phase A and 0.5% acetic acid as mobile phase B； the samples were gradiently eluted at the ratios of phase A∶B as 20∶80 in 0～100 minutes and 40∶60 after 105 minutes； and the detection was carried out with 360 nm of wavelength， 35℃ of column temperature and 1.0 mL/min of volume flow rate. The detection method was verified with the leaves of two persimmon varieties， and the expected results were obtained， which indicated that the established method was feasible.

Key words Persimmon leaves； Flavonoid； HPLC； Simultaneous detection

柿葉中含有豐富的黃酮苷、蘆丁、三萜類、酚類、膽堿、維生素C、胡蘿卜素、香豆素、植物甾醇類、有機(jī)酸、脂肪酸、揮發(fā)油、生物堿、還原糖、多糖、鞣質(zhì)、香脂精、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的營養(yǎng)成分[1]。近幾年，隨著人們越來越注重健康的生活，柿葉的功能成分逐漸受到重視。

黃酮類物質(zhì)是柿葉中最主要的功能成分，已發(fā)現(xiàn)的柿葉黃酮類物質(zhì)主要有紫云英苷、黃芪苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰酚、蘆丁、蕓香苷、金絲桃苷、楊梅樹皮苷等[2]。對柿葉黃酮的開發(fā)研究，可提高柿樹的利用效率，增加其經(jīng)濟(jì)效益。

目前，對于柿葉黃酮的研究主要是總黃酮或少量幾種黃酮類物質(zhì)的提取[3～5]、檢測方法及含量分析[6，7]，以及不同品種間總黃酮含量的比較[8]。關(guān)于同時(shí)檢測柿葉中6種黃酮類物質(zhì)的方法迄今未見報(bào)道。筆者以西村早生和禪寺丸兩個(gè)品種的柿葉為材料，通過對液相色譜條件的摸索，建立了一種同時(shí)檢測6種柿葉黃酮類物質(zhì)的液相色譜檢測方法，為適宜柿葉茶等深加工的高黃酮柿樹品種的選育做前期探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 索氏提取器；Agilent LC1260 高效液相色譜儀；DAD紫外二極管陣列檢測器；ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm，5 μm色譜柱。

1.1.2 試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、山柰素標(biāo)準(zhǔn)品、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自Sigma；色譜級(jí)甲醇，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)冰乙酸，購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.1.3 柿葉樣品 西村早生和禪寺丸兩個(gè)品種的柿葉樣品取自山東省果樹研究所萬吉山柿樹試驗(yàn)示范基地。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜檢測條件的選擇 檢測波長的確定：對6種標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行紫外全波長掃描，根據(jù)吸收光譜圖中的吸收峰確定檢測波長。

流動(dòng)相的選擇：以乙腈-0.5%乙酸、甲醇-0.5%乙酸為流動(dòng)相，根據(jù)分離效果選擇適宜流動(dòng)相。

流動(dòng)相比例的選擇：比較甲醇-0.5%乙酸比例分別為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40的流動(dòng)相，根據(jù)分離效果確定最佳流動(dòng)相比例。

柱溫的選擇：比較25、30、35、40℃幾種柱溫條件下的分離效果，確定最適柱溫。

體積流量的選擇：比較0.4、0.8、1.0 mL/min不同體積流量，根據(jù)峰型及分離效果確定最佳體積流量。

1.2.2 校正表的建立 精密稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.1 mg，異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品5.1 mg，紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品5.2 mg，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品5.1 mg，山柰素標(biāo)準(zhǔn)品4.9 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容并搖勻。精密稱量異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品5.2 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容并搖勻。取蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰素標(biāo)準(zhǔn)品母液各4 mL，取異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品母液20 mL，混合置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。分別取混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行檢測，計(jì)算校正表。

1.2.3 液相色譜檢測方法的驗(yàn)證 樣品溶液的制備：將新鮮葉片洗凈，105℃殺青15 min后于70℃烘干。干燥葉片經(jīng)0.5 mm孔篩粉碎，得樣品粉末。稱取樣品粉末約1 g，置于索氏提取器中，使用四氯甲烷回流除雜后用甲醇回流提取至無色。將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液并入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。使用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，得供試樣品溶液。

樣品中6種黃酮類物質(zhì)含量的測定：精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按照建立的液相色譜條件對樣品進(jìn)行檢測。根據(jù)色譜圖，經(jīng)校正表計(jì)算，得到樣品中各黃酮類物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相檢測條件的建立

2.1.1 檢測波長的確定 對6種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果顯示，各標(biāo)準(zhǔn)品在257 nm和360 nm處均有較高的吸收峰（圖1）。但是257 nm處受到溶劑吸收峰等干擾，故選擇360 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動(dòng)相的確定 對乙腈-0.5%乙酸、甲醇-0.5%乙酸兩種流動(dòng)相體系的分離效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，使用乙腈-0.5%乙酸做流動(dòng)相，分離度差，且進(jìn)樣時(shí)溶劑峰較明顯；使用甲醇-0.5%乙酸做流動(dòng)相，分離效果較好，且樣品的溶解和提取均使用甲醇，因此，選用甲醇-0.5%乙酸為流動(dòng)相以減少溶劑峰的影響。

2.1.3 流動(dòng)相比例的確定 當(dāng)甲醇濃度為30∶70或以上時(shí)，混合標(biāo)準(zhǔn)品中異槲皮苷與蘆丁難以分開。當(dāng)甲醇濃度為20∶80或以下時(shí)，難以出峰。故選擇梯度洗脫，使用低甲醇比例流動(dòng)相使樣品分離，再用較高甲醇比例流動(dòng)相使樣品出峰。

以甲醇-0.5%乙酸為流動(dòng)相，比較了幾種比例流動(dòng)相的梯度效果，結(jié)果顯示，先使用20∶80流動(dòng)相，后改為40∶60可以達(dá)到分離樣品與出峰峰型較好的平衡。

2.1.4 柱溫的確定 比較了25、30、35、40℃幾種柱溫條件下的分離效果，高柱溫時(shí)保留時(shí)間短，低柱溫條件下保留時(shí)間延長，但由于峰型變寬，分離度反而降低。綜合考慮，選擇35℃作為柱溫條件。

2.1.5 體積流量的確定 經(jīng)比較，體積流量為1.0 mL/min時(shí)，峰型及分離效果均較好，因此，確定1.0 mL/min為高效液相色譜檢測的最佳體積流量。

2.1.6 液相檢測條件的確定 綜合上述結(jié)果，確定高效液相色譜檢測條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇為流動(dòng)相A，以0.5%乙酸溶液為流動(dòng)相B，按表1的條件進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為360 nm；柱溫為35℃；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.7 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖 以上述建立的條件對6種黃酮類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（圖2），6種標(biāo)準(zhǔn)品得到了很好的分離，保留時(shí)間由短至長分別為異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷、槲皮素、山柰素、異鼠李素。

2.2 校正表的建立

將6種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合，取不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（表2）注入液相色譜儀，在360 nm處檢測其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種黃酮類物質(zhì)的回歸方程（圖3）。

2.3 樣品中6種黃酮類物質(zhì)含量測定

用上述建立的方法，測定了西村早生及禪寺丸兩個(gè)品種柿葉的6種黃酮類物質(zhì)，根據(jù)色譜圖（圖4），按照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，得出西村早生中各黃酮類物質(zhì)含量（mg/g干燥葉）：異槲皮苷2.31；蘆丁0.13；紫云英苷6.8；槲皮素0.51；山柰素0.52。禪寺丸中各黃酮類物質(zhì)含量（mg/g干燥葉）：異槲皮苷1.35；蘆丁2.04；紫云英苷4.39；槲皮素1.64；山柰素2.04；異鼠李素0.075。

3 結(jié)論與討論

黃酮類物質(zhì)是一類重要的生理活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗衰老、抗癌等功能[9～14]。在中藥中測定黃酮含量已趨于成熟，《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）（一部）中詳細(xì)記載了天南星、沙棘、槐花等幾種中草藥總黃酮含量及單種黃酮類物質(zhì)含量的測定方法，以及山楂葉總黃酮含量的測定和銀杏葉總黃酮醇苷含量的測定方法[15]，其他果樹黃酮含量的測定并沒有記載。用于柿葉黃酮類物質(zhì)的檢測方法主要有分光光度法[16，17]、高效液相色譜法[6，7，18，19]和薄層色譜法[20，21]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，借鑒《中國藥典》中關(guān)于其他中草藥黃酮類物質(zhì)的測定方法，建立了一種同時(shí)測定6種黃酮類物質(zhì)的方法。

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在制備標(biāo)準(zhǔn)品母液時(shí)，由于異鼠李素在甲醇中的溶解度較低，無法達(dá)到其他標(biāo)準(zhǔn)品母液的濃度，因此，使用較大量甲醇將其溶解，得到較低濃度的母液，在配制混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液時(shí)，按比例吸取各標(biāo)準(zhǔn)品母液，使各標(biāo)準(zhǔn)品濃度相近，便于計(jì)算。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，山柰素（3，5，7-三羥基-4-甲氧基黃酮）和山柰酚（3，5，7，4-四羥基黃酮）標(biāo)準(zhǔn)品在所建立的HPLC條件下，吸收峰重疊無法分開，有可能與二者結(jié)構(gòu)極其相似有關(guān)。因此，本試驗(yàn)以山柰素為標(biāo)準(zhǔn)品分析其含量。

選擇檢測波長時(shí)，紫外全波長掃描結(jié)果顯示，各標(biāo)準(zhǔn)品在257 nm和360 nm處均有較高的吸收峰。但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)257 nm處受到溶劑峰干擾，而在360 nm處各標(biāo)準(zhǔn)品可得到較好的圖譜，所用溶劑截止波長均在257 nm以下[22]，因此，選擇360 nm為檢測波長。

選擇流動(dòng)相時(shí)，比較了乙腈-0.5%乙酸、甲醇-0.5%乙酸兩種流動(dòng)相體系的分離效果，發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.5%乙酸做流動(dòng)相，分離度差，且溶劑峰較明顯。另外，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備和樣品的提取均使用了甲醇，因此，選用甲醇-0.5%乙酸為流動(dòng)相以減少溶劑峰的影響。對于流動(dòng)相比例，選擇梯度洗脫，先使用20∶80，后改為40∶60可以取得較好的效果。在上述條件下，體積流量超過1.0 mL/min時(shí)，壓力過大，為防止對設(shè)備的損害，不考慮更大體積流量。

本試驗(yàn)建立的梯度洗脫方法，可以達(dá)到分離樣品與出峰峰型較好的平衡，但總體時(shí)間較長。對于如何在保證樣品分離度與出峰峰型的前提下，進(jìn)一步縮短總體保留時(shí)間，提高試驗(yàn)效率，有待于進(jìn)一步研究。

為驗(yàn)證所建立方法的可行性，筆者以西村早生和禪寺丸兩個(gè)品種的柿葉為樣品，測定了6種黃酮類物質(zhì)的含量。2個(gè)品種柿葉中均檢測到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰素，而異鼠李素僅在禪寺丸中有微量發(fā)現(xiàn)（0.075 mg/g干燥葉）。是否完全沒有或者含量低于可測定限值，以及哪些品種柿葉中可能含有異鼠李素，有待于進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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