46份大白菜種質(zhì)資源SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

段麗麗 鄭永勝 李華 孫加梅 王東建 王雪梅 仙麗娜 王秀娟 張晗

摘 要：利用30對(duì)SSR引物分析了46 份大白菜品種的遺傳多樣性。結(jié)果表明，30對(duì)引物共檢測(cè)到170個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物檢測(cè)到5.667個(gè)，變化范圍為2～10個(gè)；引物的多態(tài)信息含量分布范圍為0.367～0.793，平均值為0.633，等位基因多樣性指數(shù)分布范圍為0.485～0.817，平均值為0.685。UPGMA 聚類分析將 46 份大白菜品種劃分為五大類，說(shuō)明本研究中的大白菜品種具有較為豐富的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞：大白菜；遺傳多樣性；SSR；聚類分析

中圖分類號(hào)：S634.103.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）05-0005-04

Abstract Thirty primers of SSR molecular markers were used to analyze the genetic diversities of 46 Chinese cabbage varieties. The results showed that a total of 170 alleles were identified with an average of 5.667 alleles per locus， which varied from 2 to 10. The polymorphism information content （PIC） varied widely from 0.367 to 0.793 with an average value of 0.633. And the allelic diversity index varied from 0.485 to 0.817 with an average value of 0.685. Cluster analysis with UPGMA showed that the 46 Chinese cabbage varieties could be classified into five groups， which reflected that they owned abundant genetic diversities.

Key words Chinese cabbage； Genetic diversity； SSR； Cluster analysis

大白菜Brassica campestris L. ssp. pekinensis （Lour） Olsson是世界范圍內(nèi)的主要蔬菜品種之一，原產(chǎn)于我國(guó)，在我國(guó)蔬菜栽培面積中占第一位，栽培歷史悠久，品種豐富。隨著大白菜品種的日益增多，研究大白菜品種間的遺傳多樣性有利于種質(zhì)創(chuàng)新、品種鑒定和育種工作的開(kāi)展。

分子標(biāo)記是繼形態(tài)、細(xì)胞和生化標(biāo)記之后發(fā)展非常迅速的遺傳標(biāo)記技術(shù)，以DNA形式表現(xiàn)，具有不易受環(huán)境影響、多態(tài)性高和易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記在品種遺傳多樣性研究中是一種有效的技術(shù)手段，目前，應(yīng)用在遺傳多樣性分析中的分子標(biāo)記主要有AFLP、ISSR和SSR等，其中SSR標(biāo)記以其豐富的多態(tài)性被廣泛應(yīng)用于蔬菜作物。SSR 標(biāo)記又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列，具有共顯性、高度重復(fù)性、多態(tài)性好、穩(wěn)定可靠以及經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于作物遺傳多樣性研究，例如大麥[1，2]、大豆[3]、水稻[4]、小麥[5]等中。楊華等[6]利用SSR標(biāo)記對(duì)61份蕓薹屬蔬菜進(jìn)行遺傳多樣性分析，將材料分為甘藍(lán)和白菜兩大類。黃寶勇等[7]對(duì)11個(gè)大白菜用 RAPD 進(jìn)行親緣關(guān)系分析，當(dāng)遺傳距離為0.18 時(shí)，11 份材料分為兩類生態(tài)群，一類群為直筒類型，另一類群在遺傳距離為0.15時(shí)，又可分為矮樁型、直筒與矮樁的過(guò)渡型兩個(gè)類群，說(shuō)明大白菜生態(tài)多樣性豐富。郭晶心等[8]采用 AFLP 對(duì) 137份白菜類群體的聚類分析表明，大白菜和薹菜親緣關(guān)系密切，蕪菁和白菜類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，小白菜的起源較大白菜早，而大白菜的遺傳多樣性較為狹窄。

本研究利用30對(duì)SSR引物對(duì)近十幾年進(jìn)行新品種保護(hù)的大白菜品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在從分子水平上明確大白菜品種資源的遺傳多樣性，為大白菜品種育種、種質(zhì)創(chuàng)新和品種鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為46 份大白菜種質(zhì)資源（表1），分別來(lái)自北京、杭州、濟(jì)南、萊州、臨朐、青島、上海、沈陽(yáng)、天津、濰坊、新鄉(xiāng)、楊凌。其中13份為收集的已知品種，33份為近幾年申請(qǐng)新品種權(quán)的品種。

1.2 基因組DNA 提取

采用Weising等[9]的CTAB法提取白菜基因組DNA。取幼嫩葉片0.2 g放入1.5 mL離心管中，在液氮中研碎；將DNA提取液預(yù)熱到65℃，每管加入400 μL，混勻樣品；將離心管置于65℃金屬浴或水浴鍋中，保溫30 min后取下；向離心管中加入400 μL 24∶1 的氯仿∶異戊醇（V/V），振蕩混勻，10 000×g離心10 min；將上清液200 μL轉(zhuǎn)入另一只1.5 mL離心管，加入400 μL-20℃預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀DNA；10 000×g離心1 min，棄上清液，加入500 μL乙醇-乙酸銨溶液（稱取0.1546 g乙酸銨，放入燒杯中，加入140 mL無(wú)水乙醇，用去離子水定容至200 mL），6 000×g離心5 min收集沉淀；加入100 μL TE （pH 8.0）溶液溶解DNA，檢測(cè)DNA濃度，-20℃保存。

1.3 SSR 分析

PCR反應(yīng)所使用的SSR引物來(lái)自于收集的文獻(xiàn)，從中篩選擴(kuò)增條帶清晰、可重復(fù)、多態(tài)性好且均勻分布于大白菜10對(duì)染色體上的30對(duì)引物用于本研究。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：含每種dNTP各0.25 mmol/L，正、反向引物各0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，1×PCR緩沖液（不含Mg2+）10 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，樣品DNA 10～40 ng。

PCR反應(yīng)程序：采用梯度PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，每個(gè)循環(huán)降1℃，共15個(gè)循環(huán)；94℃變性45 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4 五色熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)

將6-FAM（藍(lán)色）和HEX（綠色）熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋30倍，TAMRA（黑色）和ROX（紅色）熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物稀釋10倍，分別取等體積的上述4種稀釋后溶液混勻；取1 μL混合液加入0.1 μL LIZ-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9 μL去離子甲酰胺加入到DNA分析儀專用深孔板孔中；然后將其在PCR儀上95℃變性5 min，取出，立即置于碎冰上，冷卻10 min以上；瞬時(shí)離心10 s后置放到DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，用GENEMAPPER進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)采集；以pBR322 DNA/MspI為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，將每一位點(diǎn)待測(cè)樣品和相應(yīng)的參照品種擴(kuò)增片段的帶型和移動(dòng)位置進(jìn)行比較，根據(jù)參照品種的移動(dòng)位置和擴(kuò)增片段大小，確定待測(cè)樣品該位點(diǎn)的等位變異大小，純合位點(diǎn)的等位變異記錄為X/X，雜合位點(diǎn)的等位變異記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異片段大小，小片段在前，大片段在后；無(wú)效等位變異記錄為0/0。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用PowerMaker 3.25[10]軟件進(jìn)行分析，計(jì)算每對(duì)引物的等位基因數(shù)（A）、等位基因頻率、基因多樣性指數(shù)（He）和多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的多態(tài)性分析

利用30對(duì)SSR引物對(duì)46份大白菜品種進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)到170個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)檢測(cè)到5.667個(gè)，變化范圍為2～10個(gè)。其中引物cnu327、nia98和cnu537分別檢測(cè)到10個(gè)等位基因，引物cnu46和cnu182分別檢測(cè)到8個(gè)等位基因。SSR位點(diǎn)的平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.633，變幅為0.367～0.793。其中26對(duì)引物的PIC大于0.500，占所有引物的86.67%，引物cnu327的PIC值最高，nia86的PIC值最低（表2）。綜上所述，這30個(gè)SSR位點(diǎn)在46份大白菜中的PIC值分布相對(duì)均勻，且多態(tài)性較高的位點(diǎn)較多。

30對(duì)SSR引物的基因多樣性指數(shù)分布范圍為0.485～0.817，平均值為0.685，引物cnu327的基因多樣性指數(shù)最大，nia86的基因多樣性指數(shù)最小。其中28（93.33%）對(duì)引物的基因多樣性指數(shù)大于0.500，說(shuō)明試驗(yàn)材料的遺傳變異豐富，具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 聚類分析結(jié)果

根據(jù)30對(duì)SSR 引物的檢測(cè)結(jié)果，按 UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，46份大白菜品種在遺傳距離為2.5處可劃分為五大類（圖 1）。

第一類包括12個(gè)品種，有浙白6號(hào)、西白9號(hào)、豫新3號(hào)、豫新2號(hào)、豫新1號(hào)、四季翠、青研四號(hào)、魯白15號(hào)、西白10號(hào)、鄭白75、新早58、金華元19號(hào)。

第二類包括西春白3號(hào)、青研春白一號(hào)、萊白38和熱抗7號(hào)4個(gè)品種。

第三類有17個(gè)品種，為西由鐵根、濰白七號(hào)、濰白九號(hào)、金來(lái)秋白一號(hào)、金來(lái)秋白2號(hào)、西白4號(hào)、金來(lái)秋白五號(hào)、金來(lái)秋白6號(hào)、濰白六號(hào)、濰白二號(hào)、中白78號(hào)、濰白秋玉、濰白四號(hào)、天正超白二號(hào)、萊白一號(hào)、熱抗白50和四季紅運(yùn)。

第四類包括中白62號(hào)、遼白十號(hào)、珍綠6號(hào)、新三號(hào)、秋玉78、豐南F115-93、濰白69、濰白八號(hào)、魯白16號(hào)、西白5號(hào)、西白3號(hào)，共11個(gè)品種。

第五類僅有冠春和秋早9號(hào)2個(gè)品種。

大部分來(lái)源于同一個(gè)地方的大白菜品種聚在一起，如豫新系列的品種和鄭白75、新早58都聚在第一類；濰白系列的品種多數(shù)聚在第三類中，而濰白69和濰白八號(hào)聚在第四類中，或許是因?yàn)橛H緣關(guān)系不同導(dǎo)致劃分入不同類群。

3 討論與結(jié)論

3.1 46份大白菜的遺傳多樣性分析

研究大白菜品種資源的遺傳多樣性可為大白菜品種育種、種質(zhì)創(chuàng)新和品種鑒定提供理論依據(jù)。本研究利用30對(duì)SSR引物檢測(cè)到170個(gè)等位基因，變化范圍為2～10個(gè)，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)檢測(cè)到5.667個(gè)，這與其他研究結(jié)果相比相對(duì)較高。隋光磊等[11]利用28對(duì)SSR標(biāo)記檢測(cè)到112個(gè)等位基因，平均每個(gè)引物 4個(gè)。本研究中SSR引物檢測(cè)到的平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.633，變幅為0.367～0.793，這比隋光磊等[11]檢測(cè)的PIC 值平均為0.5、變幅為0.22～0.65相對(duì)高。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因或許與研究材料選擇有關(guān)，本研究所用試驗(yàn)材料多數(shù)為近幾年新育成品種，可能隨著育種技術(shù)的不斷完善，大白菜育成品種的遺傳多樣性越來(lái)越豐富。另一方面可能與試驗(yàn)所選擇的SSR引物標(biāo)記的數(shù)量、質(zhì)量和采集SSR數(shù)據(jù)的試驗(yàn)方法不同有關(guān)，本試驗(yàn)中采集大白菜DNA數(shù)據(jù)采用的是五色熒光毛細(xì)管電泳法，而隋光磊等[11]采用的是普通的6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）法，試驗(yàn)表明，與基于普通SSR標(biāo)記的DNA指紋鑒定方法相比，基于SSR熒光標(biāo)記的 DNA 指紋鑒定效率更高、結(jié)果更準(zhǔn)確。

3.2 46份大白菜的親緣關(guān)系

通過(guò)聚類分析，46份大白菜材料在遺傳距離為2.5處可以分為五大類，第一大類包括12個(gè)品種，又可分為3大亞類，其中來(lái)自河南的豫新1號(hào)、豫新2號(hào)和豫新3號(hào)都被劃分在第二大亞類中，說(shuō)明來(lái)源于同一個(gè)地方的品種親緣關(guān)系較近。第三大類包括17個(gè)品種，除了濰白69和濰白八號(hào)聚在第四類中，其余濰白系列的品種都聚在第三類中，可能是由于它們的遺傳來(lái)源不同而被劃分在不同的類群中。

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