自體多免疫細(xì)胞療法聯(lián)合恩替卡韋治療慢性乙型活動(dòng)性肝炎的短期療效觀察

俞哲 劉軍權(quán) 李佳佳 王琛 王飛 李曉鷗 駱欣

[摘要] 目的 探討多種自體免疫細(xì)胞與恩替卡韋聯(lián)合治療慢性乙型活動(dòng)性肝炎的抗病毒療效。 方法 將2015年4～9月我院收治的慢性活動(dòng)性乙型病毒性肝炎患者26例分為兩組（對(duì)照組和聯(lián)合治療組），兩組均予以抗病毒治療，其中聯(lián)合治療組12例接受多細(xì)胞免疫療法聯(lián)合恩替卡韋治療，對(duì)照組14例單用恩替卡韋治療。并分離單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)γδ T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞，治療8～12周后評(píng)價(jià)其療效。 結(jié)果 治療前兩組患者在ALT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，聯(lián)合治療組HBsAg下降速率（治療前/治療后）與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）；ALT、HBV DNA在治療前后，聯(lián)合治療組下降幅度大于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而HBeAg兩組對(duì)比無(wú)顯著性差異。聯(lián)合組不良反應(yīng)輕微。 結(jié)論 自體多免疫細(xì)胞療法聯(lián)合恩替卡韋可促進(jìn)HBsAg清除，對(duì)HBV的清除可能有幫助。

[關(guān)鍵詞] 自體免疫細(xì)胞；NK細(xì)胞；NKT細(xì)胞； γδT細(xì)胞；恩替卡韋；慢性乙型病毒性肝炎

[中圖分類(lèi)號(hào)] R575.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）06-0022-04

Study on the short-term efficacy of autologous immune cell therapy combined with entecavir in the treatment of chronic hepatitis B

YU Zhe LIU Junquan LI Jiajia WANG Chen WANG Fei LI Xiaoou LUO Xin

Department of Liver Disease of the Hangzhou Xixi Hospital， Hangzhou Sixth People's Hospital， Hangzhou 310023，China

[Abstract] Objective To evaluate the efficacy of treatment for hepatitis B virus combined entecavir with a variety of autoimmune cells. Methods 26 hospital patients with chronic hepatitis B were divided into two groups（control group and combination treatment group） voluntarily during the period from April to September in 2015. All patients were in accordance with the indications for anti viral treatment. The combination treatment group included 12 patients received treatment combined entecavir with a variety of autoimmune cells and the control group involved 14 patiens accepted treatment of entecavir alone. Mononuclear cells were isolated， γδ T cells， NK cells， NKT cells were cultured in vitro. The efficacy of the two groups were evaluated after 8-12 weeks. Results There were no statistically significant differences in ALT， HBsAg， HBeAg， HBV DNA between the two groups before treatment. There were significant differences in the decrease rate of HBsAg（before/after treatment） between the two groups（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）； The efficacy of treatment group was greater than the control group in ALT， HBV DNA， but there was no statistically significant difference（P>0.05）. There was no significant difference between the two groups in the inhibition of HBeAg. Adverse reactions in the treatment group were mild. Conclusion Multicellular autologous immunotherapy combined with entecavir could promote removal of HBsAg. Multicellular autologous immunotherapy may be helpful to the removal of HBV.

[Key words] Autologous immune cells； NK cell； NKT cell； γδT cell； Entecavir； Chronic hepatitis B

多免疫細(xì)胞療法是一群具有較強(qiáng)免疫活性的細(xì)胞聯(lián)合治療相應(yīng)疾病的簡(jiǎn)稱(chēng)，主要包括病毒特異性CTL、NK細(xì)胞、γδT細(xì)胞、NKT細(xì)胞等多種細(xì)胞。其中NK細(xì)胞與NKT細(xì)胞是肝臟固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中的主要淋巴細(xì)胞，這兩種細(xì)胞約占肝臟淋巴細(xì)胞的50%。當(dāng)HBV急性感染時(shí)，肝臟內(nèi)的NKT能直接激活細(xì)胞防御基因家族，誘導(dǎo)β干擾素的分泌，直接抑制病毒DNA復(fù)制[1-4]。γδT細(xì)胞介于固有和適應(yīng)性免疫的T細(xì)胞，是免疫防御的第一防線，具有免疫調(diào)節(jié)、參與多種細(xì)菌與病毒的免疫應(yīng)答等作用[5]。提高機(jī)體的T淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的細(xì)胞免疫功能及增加協(xié)同細(xì)胞因子等多種方法聯(lián)合對(duì)于清除病毒、打破免疫耐受將起到重要的作用[6]。恩替卡韋（entecavir，ETV）是目前最常用的核苷酸類(lèi)抗病毒藥物，由于具有抗病毒效果迅速、耐藥率低等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床[7]。但核苷類(lèi)似物只能抑制HBV DNA復(fù)制，并不能徹底清除乙肝病毒[8]，致使患者需要多年服用抗病毒藥物。多種免疫細(xì)胞，對(duì)于提高患者固有免疫和針對(duì)HBV的特異性免疫功能有幫助，與恩替卡韋聯(lián)合應(yīng)用，有可能促進(jìn)HBV的清除。本研究收集自體多免疫細(xì)胞聯(lián)合恩替卡韋治療慢性乙型活動(dòng)性肝炎患者資料，與單用恩替卡韋治療為對(duì)照，初步分析療效、不良反應(yīng)等臨床資料，現(xiàn)將前期研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年4～9月我院收治的慢性活動(dòng)性乙型病毒性肝炎患者26例，符合“2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)制定的《乙型肝炎防治指南》”中的診斷標(biāo)準(zhǔn)和抗病毒治療適應(yīng)證，排除非活動(dòng)性HBsAg攜帶者/慢性HBV攜帶者、合并其他肝損疾患（其他嗜肝病毒重疊感染、藥物性、酒精性、自身免疫性、代謝性等）、失代償期肝硬化、肝功能衰竭、活動(dòng)性出血、重要臟器功能障礙、出凝血功能障礙、妊娠、正在使用免疫抑制藥物，或器官移植后長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等患者。經(jīng)知情告知，患者自主選擇，分為恩替卡韋、自體多免疫細(xì)胞聯(lián)合治療組12例，男10例，女2例，年齡（37.41±7.54）歲；單用恩替卡韋對(duì)照組（ETV組）14例，男12例，女2例，年齡（35.36±8.26）歲。兩組患者在性別、年齡方面比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組患者均符合抗病毒治療適應(yīng)證，經(jīng)知情告知，患者均選擇恩替卡韋分散片（正大天晴藥業(yè)有限公司，0.5 mg/片：國(guó)藥準(zhǔn)字H20100019）0.5 mg口服，1次/d，抗病毒治療。

1.2.2 觀察指標(biāo) 兩組患者在抗病毒治療前1～3 d晨起空腹采血檢測(cè)血常規(guī)、生化、乙肝三系、HBV DNA等指標(biāo)，聯(lián)合治療組患者同時(shí)機(jī)采外周血150 mL進(jìn)行分離、定向培養(yǎng)。治療后8～12周對(duì)兩組患者上述指標(biāo)進(jìn)行復(fù)檢。

1.2.3 自體多免疫細(xì)胞分離、培養(yǎng)、回輸操作方法

1.2.3.1 單核細(xì)胞的分離 機(jī)采患者外周血150 mL，轉(zhuǎn)入50 mL離心管，離心2000 rpm，10 min，吸取血漿等分為6份，凍存于-80℃冰箱，供回輸細(xì)胞時(shí)使用；預(yù)先將淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque1077，加入50 mL無(wú)菌離心管，20 mL/管（分離單個(gè)核細(xì)胞）；吸取生理鹽水將吸取血漿后的標(biāo)本還原至原始體積，混勻，緩慢加在Ficoll-Hypaque1077上，體積比為1∶1～1.5。600 rpm，室溫離心20 min（注意調(diào)整離心機(jī)加速和減速過(guò)程為最低）；用平口巴氏滴管輕輕插入到單個(gè)核細(xì)胞層，沿著管壁吸取該層，每管加生理鹽水至50 mL，輕輕吹勻細(xì)胞，離心洗滌3次，除去血小板和分離介質(zhì)。棄去上清，用無(wú)血清1640培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)；將分離得到的單核細(xì)胞進(jìn)行分成3份，分別用作γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞的培養(yǎng)。

1.2.3.2 γδT細(xì)胞的培養(yǎng) 取1.2.3.1步驟獲得的PBMC細(xì)胞一份，以細(xì)胞濃度1×106/mL加入適量細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入預(yù)刺激因子：A1、自體血漿10%；在培養(yǎng)的第2天加入A2和A3，第3天再加入A4，3 d以后視培養(yǎng)情況補(bǔ)液或傳代，第13天收集細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸浮，總體積為200 mL，靜脈回輸患者，第1天回輸共2次。

1.2.3.3 NK細(xì)胞的培養(yǎng) 取1.2.3.1步驟獲得的PBMC細(xì)胞一份，以細(xì)胞濃度1×106/mL加入適量細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入預(yù)刺激因子：E1、自體血漿10%；在培養(yǎng)的第2天加入E2，第3天再加入E3、E4、E5，3 d以后視培養(yǎng)情況補(bǔ)液或傳代，第14天收集細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸浮，總體積為200 mL，靜脈回輸患者，第2天回輸共2次。

1.2.3.4 NKT細(xì)胞的培養(yǎng) 取步驟1.2.3.1 PBMC細(xì)胞一份，以細(xì)胞濃度1×106/mL加入適量細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入預(yù)刺激因子：B1、自體血漿10%；在培養(yǎng)的第2天加入B2，第3天再加入B3、B4，3 d以后視培養(yǎng)情況補(bǔ)液或傳代，第15天收集細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸浮，總體積為200 mL，靜脈回輸患者，第3天回輸共2次。

1.2.3.5 細(xì)胞的質(zhì)量控制 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，取樣進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)；每次回輸前1 h通過(guò)凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。細(xì)胞2℃～6℃冷鏈運(yùn)輸，2 h內(nèi)回輸患者體內(nèi)，并記錄每次輸注細(xì)胞后有無(wú)寒戰(zhàn)、發(fā)熱及過(guò)敏等癥狀。

1.2.3.6 細(xì)胞回輸過(guò)程中的護(hù)理 制備好的細(xì)胞懸液灌裝于生理鹽水中，體積為100 mL，用一次性輸血器靜脈滴注，速度40滴/min，為避免細(xì)胞堵塞輸血器管腔或黏附管壁，輸注完畢后用20 mL生理鹽水沖洗輸液瓶和管道。在細(xì)胞輸注過(guò)程中，由專(zhuān)職護(hù)士全程負(fù)責(zé)，嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)操作原則，如有不良反應(yīng)，及時(shí)匯報(bào)醫(yī)生處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（25分位數(shù)，75分位數(shù)）M（P25，P75）表示，兩樣本比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前情況比較

治療前兩組患者在ALT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

2.2 兩組治療后情況比較

聯(lián)合治療組HBsAg下降速率（治療前/治療后）與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示自體多免疫細(xì)胞療法聯(lián)合恩替卡韋對(duì)HBsAg抑制程度顯著高于單用恩替卡韋組（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）；ALT、HBV DNA在治療前后，聯(lián)合治療組下降幅度大于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而HBeAg兩組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表3。

2.3 不良反應(yīng)

本研究過(guò)程中，每次回輸后密切臨床觀察半小時(shí)以上，12例患者僅有1例患者在細(xì)胞回輸時(shí)輕微發(fā)熱，經(jīng)密切觀察，未予特殊處理，2～4 h內(nèi)體溫恢復(fù)正常，其余患者無(wú)明顯不良反應(yīng)。

3 討論

研究表明慢性乙肝的整個(gè)病程進(jìn)展與HBV持續(xù)感染所導(dǎo)致的機(jī)體免疫功能障礙有著較緊密的關(guān)系[9]。其他大多數(shù)患者通常采用核苷類(lèi)似物或/和IFN-α抗病毒治療，雖然具有一定的臨床療效，但均難以徹底清除病毒[6]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，部分擁有健全的免疫功能感染者可以依靠較強(qiáng)的免疫力將病毒清除而獲得痊愈[10]。肝臟中NK、NKT及γδT細(xì)胞等非特異性免疫細(xì)胞含量豐富，可占全部肝臟淋巴細(xì)胞的2/3，在抗HBV感染免疫中起到了很重要的作用[2-4]，有研究表明[11]乙肝患者外周血來(lái)源的γδT細(xì)胞存在某些免疫功能的降低，其可能是乙肝慢性化的重要因素。而其他研究表明經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的γδT細(xì)胞可高分泌IFN-γ和GM-CSF等細(xì)胞因子，并經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)二次分布，聚集于肝臟組織內(nèi)，通過(guò)IFN的旁分泌對(duì)整合于肝細(xì)胞中的HBV DNA進(jìn)行直接抑制和清除對(duì)于提高機(jī)體病毒清除率，同時(shí)建立肝臟局部的免疫平衡有著重要的意義[12，13]。而NK和NKT細(xì)胞作為肝臟固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中的主要淋巴細(xì)胞，在感染HBV時(shí)，能誘導(dǎo)干擾素β的分泌，直接抑制病毒DNA的復(fù)制[15]，更有研究表明γδT 細(xì)胞可能直接參與了HBV急性感染與清除的過(guò)程[16]?？岛Ｑ嗟萚17]利用DC-CIK聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎時(shí)，聯(lián)合治療組肝功能改善、HBV DNA下降明顯優(yōu)于干擾素治療組，應(yīng)用免疫細(xì)胞和核苷酸類(lèi)似物聯(lián)合抗病毒治療可打破免疫耐受，維持機(jī)體的免疫平衡，將利于HBV DNA的清除。本研究中，聯(lián)合治療組ALT、HBV DNA下降幅度略大于單行恩替卡韋治療結(jié)果，雖無(wú)明顯差異（P>0.05），但也提示多細(xì)胞治療有可能在輔助降低HBV病毒量及改善肝功能上有重要作用。

本研究中發(fā)現(xiàn)恩替卡韋在聯(lián)合多細(xì)胞治療結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組的HBsAg下降幅度明顯優(yōu)于單恩替卡韋組。HBsAg是HBV的外膜蛋白，通過(guò)HBV表面基因轉(zhuǎn)錄和翻譯形成，在病毒感染肝細(xì)胞過(guò)程中其重要作用，HBsAg與肝內(nèi)cccDNA密切相關(guān)，HBsAg定量檢測(cè)能較好的反應(yīng)HBV的復(fù)制狀態(tài)，對(duì)接受核苷類(lèi)抗病毒治療HBV DNA陰轉(zhuǎn)后的進(jìn)一步療效觀察具有重要的臨床意義[18]。黃躍雁等[19]研究認(rèn)為，HBsAg的初始水平和中間下降水平均可作為干擾素治療HBeAg陽(yáng)性慢性乙肝的早期預(yù)測(cè)標(biāo)志，若HBsAg下降較快預(yù)示有較好的預(yù)后，反之則需要延長(zhǎng)治療時(shí)間或聯(lián)合其他藥物治療。HBsAg下降幅度越大，HBeAg抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生率就越高。上述研究均說(shuō)明了抗病毒治療期間，HBsAg下降幅度與預(yù)后有較大的聯(lián)系，提示多細(xì)胞聯(lián)合恩替卡韋有可能在縮短抗病毒治療時(shí)間，提高預(yù)后效果上有重要意義。

在安全性方面，除在回輸過(guò)程中出現(xiàn)1例一過(guò)性發(fā)熱外，未出現(xiàn)其他明顯不良反應(yīng)[20]。本研究初步顯示了多細(xì)胞聯(lián)合核苷酸類(lèi)似物在治療乙型肝炎上的可行性和有效性，但由于研究隨訪時(shí)間短，患者樣本量較少，仍需要進(jìn)一步開(kāi)展大樣本研究加以驗(yàn)證。

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（收稿日期：2015-12-22）