鉤藤堿對癡呆模型小白鼠學(xué)習(xí)記憶的干預(yù)作用研究

朱文娟 程金生

[摘要] 目的 研究貓爪草提取物鉤藤堿對癡呆模型小白鼠學(xué)習(xí)記憶的干預(yù)作用。 方法 采用免疫組化分析及半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）測定鉤藤堿（rhynchophylline，RH）對快速老化癡呆型小白鼠（SAMP8）腦內(nèi)β位點APP裂解酶（β-site APP cleavage enzyme，BACE）、β-淀粉樣蛋白前體（β-site amyloid precursor protein，AβPP）及淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積表達(dá)。 結(jié)果 在小鼠探索實驗中，SAMP8組小鼠停留原平臺象限時間（18.59±7.72）s，穿越平臺次數(shù)為（1.00±0.95）次，而鉤藤堿中劑量組兩組對應(yīng)時間分別為（27.02±8.77）s和（2.30±1.07）次。與對照組相比，鉤藤堿實驗組癡呆模型小白鼠在原來的平臺各象限中的駐留時間顯著變長，且另一方面，該實驗組小鼠穿越原來的平臺的次數(shù)有明顯的增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿各劑量能明顯降低SAMP8腦內(nèi)Aβ平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元數(shù)，如SAMP8組皮層Aβ平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)分別為（0.326±0.094）和（69.91±9.31），而鉤藤堿中劑量組對應(yīng)值分別為（0.242±0.074）和（39.94±8.56）。且采用鉤藤堿干預(yù)后，SAMP8小白鼠腦內(nèi)BACE、APP mRNA含量也呈現(xiàn)下降趨勢，如鉤藤堿高劑量組AβPP mRNA表達(dá)值為（84.00±5.03），與SAMP8組對應(yīng)值（110.11±30.51）。以上效應(yīng)均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。 結(jié)論 鉤藤堿能較好地抑制APP裂解酶、β-淀粉樣蛋白前體及淀粉樣蛋白的過度生成，從而保護(hù)小鼠的神經(jīng)元免受淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性影響，進(jìn)而改善快速老化癡呆模型小白鼠SAMP8的學(xué)習(xí)記憶能力。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默??；小鼠；記憶；貓爪草

[中圖分類號] R749.16；R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）06-0012-07

Intervention of rhynchophylline on the learning and memory abilities of a dementia mouse model

ZHU Wenjuan1 CHENG Jinsheng2

1.Department of Pathology， the 1st People's Hospital of Huzhou City in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China； 2.School of Medicine， Jiaying University， Meizhou 514031， China

[Abstract] Objective To research the intervention of rhynchophylline extracted from root of catclaw buttercup on the learning and memory abilities of a dementia mouse model. Methods The expressions of beta-site APP cleaving enzyme （BACE）， amyloid-β precursor protein（AβPP） and Aβ in senescence accelerated mouse prone 8（SAMP8） mouse brain were studied by immunohistochemical analysis and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） analysis etc. Results Comparing with the control group， in spatial exploration test of the RH-treated group， the staying time and the frequency of striding over primary terrace quadrant increased significantly. For example， the staying time of original platform and frequency of crossing original platform of SAMP8 group were（18.59±7.72） sec and（1.00±0.95） time， respectively. While for mid-dose of RH group， the data changed to（27.02±8.77） sec and（2.30±1.07） time， respectively. The Aβ mean optical density as well as the brain immunoreactive neurons of the RH cured group would decrease significantly comparing with SAMP8 group. For example， for SAMP8 group， mean optical density and the brain immunoreactive neurons were（0.326±0.094） and（69.91±9.31），while for mid-dose， mean optical density and the brain immunoreactive neurons would change to （0.242±0.074） and （39.94±8.56）. The mRNA contents of BACE and AβPP also decline after rhynchophylline intervention. For example， for high-dose RH goup， the AβPP mRNA expression was （84.00±5.03）， while for SAMP8 group， the data was （110.11±30.51）. All of these effects showed a dose-effect relationship. Conclusion All the results in this work indicate that rhynchophylline can improve the learning and memory abilities in SAMP8 by inhibit the expression of BACE， AβPP and Aβ in SAMP8 brain， leading to protection of the neurons from the nuerotoxicity of Aβ.

[Key words] Alzheimer Disease； Mice； Memory； Root of catclaw buttercup

阿爾茨海默氏病（Alzheimer's disease，AD）的臨床表現(xiàn)是患者的認(rèn)知功能和記憶功能越來越差[1]。典型病理特征為腦部β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積并聚集形成老年斑（senile plaque，SP），且主要存在于與腦部與記憶和認(rèn)知相關(guān)的特定區(qū)域[2]。進(jìn)一步的研究表明，大量老年斑聚集、β淀粉樣肽的大量變性沉積以及細(xì)胞內(nèi)蛋白異常磷酸化導(dǎo)致的大量神經(jīng)原的纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）其病患腦部的顯著病理學(xué)特征[3，4]，這也是AD發(fā)病機制中重要的環(huán)節(jié)之一。諸多證據(jù)表明，包括上述Aβ沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)等因素與AD的發(fā)病機制密切相關(guān)[5，6]。盡管西方國家已批準(zhǔn)9-氨基四氫吖啶及石杉堿甲等藥物用于阿爾茨海默氏病的治療，但治療效果仍不盡人意，有必要探索包括中草藥在內(nèi)的AD替代治療方法[7]。

越來越多的臨床證據(jù)顯示，一些中草藥對提升輕度至中度阿爾茨海默癥患者的學(xué)習(xí)和記憶能力有很大幫助[8，9]。鉤藤堿是由傳統(tǒng)中藥鉤藤[來源于一些藥用植物如釣鉤藤10（Uncaria rhynchophylla，也稱魚鉤藤，圖1）和絨毛鉤藤[11]（Uncaria tomentosa，也稱貓爪草）等]中提取的一種生物堿，臨床應(yīng)用較多。鉤藤堿屬于非競爭性拮抗劑和鈣離子通道阻斷劑[12-15]。

目前，國內(nèi)外已有中藥干擾或治療阿爾茨海默病相關(guān)研究[16-21]，但尚未見鉤藤堿對阿爾茨海默病干擾相關(guān)研究。本工作探索通過凝膠電泳和免疫組化方法等技術(shù)研究鉤藤堿對β淀粉樣蛋白Aβ聚集體形成及Aβ纖維解聚的體外干預(yù)效應(yīng)。觀察鉤藤堿對快速老化癡呆模型小白鼠SAMP8的學(xué)習(xí)記憶能力的改善效果。

1 資料與方法

1.1 動物來源

6月齡快速老化癡呆型小白鼠和正常老化小白鼠（SAMR1，雄性）由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，SPF級，體重18～22 g，所有動物實驗均符合動物實驗倫理準(zhǔn)則。

1.2 試劑

一抗：β-淀粉樣蛋白前體及兔抗大鼠多克隆抗體（購自Invitrogen公司）；二抗：即用型快捷MaxvisionTM檢測試劑盒；DAB顯色試劑盒購自Invitrogen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和瓊脂糖購自上海生工有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），石杉堿甲，Trizol試劑及PCR TaqMix由Gene Tech 公司購得；鉤藤堿由嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院自制，純度98.3%，鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）由中國標(biāo)準(zhǔn)（成都）有限公司提供。

1.3 倫理聲明

本工作包含的所有動物實驗均符合國際動物倫理準(zhǔn)則，并獲得學(xué)校相關(guān)動物倫理委員會的批準(zhǔn)（以書名報告的形式獲得批準(zhǔn)，審批編號為20140325）。本工作也是在廣東省實驗動物準(zhǔn)則的規(guī)范下進(jìn)行的。所有的實驗均努力降低實驗動物的使用數(shù)量以及它們所承受的痛苦度。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組方法 給藥及研究試劑6月齡的快速老化癡呆型小白鼠（SAMP8，雄性）50只被隨即平均分為SAMP8組、huperzine A（石杉堿甲）陽性對照組、RH（鉤藤堿）低、中及高劑量組，共五組。10只6月齡正常老化小白鼠（雄性）設(shè)為另一個對照組（SAMR1對照組）。本研究中，快速老化癡呆型小白鼠對照組、正常老化小白鼠對照組喂服生理鹽水，劑量為每千克30 mL；huperzine A陽性對照組喂服huperzine A每公斤0.02 mg；RH低劑量組：喂服鉤藤堿劑量：每公斤45 mg；RH中劑量組：喂服鉤藤堿劑量：每公斤90 mg；RH高劑量組：喂服鉤藤堿劑量：每公斤180 mg；如上各實驗組每天以灌胃方式給藥一次，連續(xù)給藥50 d。研究時間：2012年5月～2014年3月。

1.4.2 隱蔽性平臺實驗、探索性實驗 隱蔽性平臺實驗：各實驗組藥物給藥結(jié)束后，開展水迷宮（Morris）試驗。所述水迷宮為一圓形池狀結(jié)構(gòu)，不銹鋼材質(zhì)，高度為50 cm，直徑為100 cm，水溫為22℃。該水迷宮共分為四個區(qū)域，被成為象限，本實驗隨即選擇任何一個象限，居中放置一個直徑10 cm的圓形小平臺，并將平臺沉于水下1 cm。上述裝置上緣安裝有與電腦鏈接的小型攝像機，并能隨時跟蹤小鼠的水下軌跡并實時分析。該隱蔽性平臺實驗共5 d，每天兩次（上、下午各一次）。小鼠面向池壁，由相鄰象限的圓池中間入池。通過攝像機記錄小鼠在百秒內(nèi)尋找到平臺的時間。一旦該實驗小鼠無法在規(guī)定的時間找到平臺，將由研究員人工牽引到平臺保持約10 s。相關(guān)數(shù)據(jù)（逃避潛伏期）被標(biāo)記為100 s。每天記錄兩次，求平均值。

探索性試驗：隱蔽性平臺實驗結(jié)束后，將上述平臺去掉，將實驗小鼠隨機放入水中，觀察在100 s內(nèi)小鼠回想尋找其記憶中的平臺的水中軌跡，并記下其穿越初始平臺的次數(shù)以及在初始象限中游泳的時間（s）。

1.4.3 生物化學(xué)檢測 免疫組化實驗：上述實驗結(jié)束后，將實驗小鼠處死，在低溫情況下快速取出實驗小鼠的腦部組織，置于超低溫冰箱中保存。每次對上述組織進(jìn)行切片分析前，一次將其放入低溫冰箱和4℃冰箱各30 min，隨后用10%的福爾馬林處理。經(jīng)相關(guān)處理（包括脫水、浸蠟、包埋等）后，切為3 μm左右切片，并選用二甲苯進(jìn)行脫蠟，并用酒精梯隊水化處理。β淀粉樣蛋白在檸檬酸緩沖溶液（pH值為6.0）修復(fù)抗原約90 s（在壓力容器內(nèi)加熱至沸騰）。各切片滴加1滴上述溶液或者H2O2溶液（3%，50 μL），在室溫下靜置10 min。從而對活性內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行有效阻斷。各切片加50 μL的β-淀粉樣蛋白前體和按1∶100稀釋的淀粉樣兔抗大鼠多克隆抗體，在常溫冰箱保溫層靜置過夜。上述各切片采用50 μL的二抗（MaxvisionTM試劑盒）室溫靜置15 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，在顯微鏡下觀察以控制時間。通過蒸餾水或去離子水及時洗滌以結(jié)束上述反應(yīng)。采用Hematoxylin（蘇木素）復(fù)染30 s，水洗滌、返藍(lán)處理、乙醇梯度脫水處理、二甲苯脫蠟處理、樹膠（中性）封片處理等，在顯微鏡下觀察。

上述切片經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色處理后，β淀粉樣蛋白及β-淀粉樣蛋白前體顯黃色。采用磷酸緩沖液替代一抗（primary antibody），以作為實驗的陰性對照。在β-淀粉樣蛋白前體等染色切片的小鼠腦部皮層以及海馬區(qū)域各取三個視野，采用病理切片分析系統(tǒng)分析各視野范圍內(nèi)β-淀粉樣蛋白前體及淀粉樣蛋白的光密度均值以及具有陽性的細(xì)胞數(shù)目。

1.4.4 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR測定BACE和APP mRNA 按Trizol試劑說明提取細(xì)胞總RNA，并檢測RNA完整性和純度，利用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。依據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心信息銀行的小鼠腦內(nèi)β位點APP裂解酶（BACE）、β-淀粉樣蛋白前體（AβPP）及淀粉樣蛋白（Aβ）的序列，以Primer premier 5.0軟件（加拿大Premier公司）來設(shè)計各蛋白上下游的引物相應(yīng)序列。

BACE上游引物為5-TGGGCTTCTGTCTTGGAG--3，下游引物為5-TATG CGATGCGAATGTTT-3；APP上游引物為5- AGATTGCGATCG CGTACTCT-3，下游引物為5-GAT TTGATCGGCGATTATTG-3；β-actin上游引物為5-TAGCGCCCG TTGGTTGTCGT-3，下游引物為5-TTGACGCCTGATAGCTGCAGCC-3，以上引物由上海生工生物工程公司合成。本工作利用上述設(shè)計的引物及PCR試劑盒各自合成β位點APP裂解酶（BACE）、β-淀粉樣蛋白前體（AβPP）及淀粉樣蛋白（Aβ）等基因。擴增反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性5 min，隨后同樣溫度變性42 s。55℃退火50 s，70℃保持1 min。共32～36個循環(huán)。72℃繼續(xù)延伸10 min。隨后，吸取10 μL擴增產(chǎn)物于凝膠電泳（含溴酚藍(lán)），參數(shù)設(shè)置為100福特，持續(xù)45 min。凝膠電泳完成紅，采用Bio-Rad凝膠成像分析儀進(jìn)行觀察。并對PCR擴增后的片段的光密度進(jìn)行掃描，得出相應(yīng)的光密度積分值。此外，掃描相同產(chǎn)品的靶基因PCR擴增產(chǎn)物及內(nèi)參的PCR擴增物的光密度，得出光密度比值一分析靶基因的表達(dá)水平。

1.4.5 鉤藤堿的制備、純化 釣鉤藤等樣品采自梅州陰那山，樣品采集后經(jīng)曬干、切段，粉碎及過篩（40 目，59.6 pm）等工序進(jìn)行預(yù)處理。取1個100 mL燒杯，加入50 mL 80%乙醇，將樣品（10 g）浸泡其中，并在-4℃冰箱靜置12 h。隨后將樣品溶液超聲1 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，收集棕色殘留物。將該棕色樣品在60℃真空干燥 24 h， 得到含有鉤藤堿成分的鉤藤總堿粗品（標(biāo)記為RH-T）。

隨后，將400 mg上述RH-T樣品溶于10 mL甲醇，超聲5 min，經(jīng)0.22 μm尼龍微孔濾膜過濾，得棕色溶液（標(biāo)記為RH-S）。

采用Waters 1525EF半制備型高效液相色譜儀對鉤藤堿進(jìn)行分離純化，色譜柱：XTerra@Prep RP18 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），流動相：甲醇：0.01 mol/L 磷酸二氫鉀（pH 8.0，以KOH調(diào)pH），體積比65∶35至 50∶50（時間30 min），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長245 nm。樣品注入量：130 μL。上述條件可以較好地將鉤藤堿組分與異鉤藤堿等其他堿分離開來。

收集保留時間在36.2～53.5 min范圍內(nèi)的鉤藤組分，薄層色譜數(shù)據(jù)顯示，該樣品比移值為0.35（與鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)一致）。樣品也分別用1H NMR（Bruker Advanced Ⅲ 500核磁共振儀，500 MHz，CDCl3為氘代試劑）、質(zhì)譜（JEOL JMS-800D質(zhì)譜儀）進(jìn)行了詳細(xì)表征，與鉤藤堿的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)基本一致[12，13]。在上述表征結(jié)果基礎(chǔ)上，重復(fù)上述HPLC分離實驗過程20次，小心收集保留時間范圍為36.2～53.5 min的所有鉤藤堿組分，將該組分放置于-80℃冰箱內(nèi)48 h，所得到的白色絮狀固體用去離子水洗滌3次除去殘留磷酸二氫鉀，隨后將洗滌后樣品再次放入-80℃冰箱內(nèi)24 h，得白色粉狀鉤藤堿固體，純度為98.3% （HPLC）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鉤藤堿表征數(shù)據(jù)

1H NMR（500 MHz，CDCl3，27℃）：δ0.723（m，3H），0.865（m，1H），1.185（m，1H），1.306（s，1H），1.603（t，1H），1.880（d，2H），2.221（m，3H），3.345（m，2H），3.567（d，2H），3.688（t，3H），6.844（s，3H），6.958（t，1H），7.103（m，1H），7.159（m，2H），7.190（m，1H），8.638（s，1H）； MS m/z 385（[M+H]+），384，383，353，170，149，148， 136，114。

2.2 小鼠隱蔽平臺及探索性實驗數(shù)據(jù)

2.2.1 隱蔽平臺實驗結(jié)果 研究指標(biāo)為逃避性潛伏期參數(shù)（單位為s），給出的是對照組以及不同藥物干擾后小白鼠5 d內(nèi)逃避潛伏期數(shù)據(jù)。見表1。

2.2.2 小白鼠探索性實驗結(jié)果 研究指標(biāo)為停留原平臺象限時間（單位為s）及穿越原平臺次數(shù)（單位為次）等參數(shù)，給出的是不同實驗組小白鼠停留原平臺象限時間、穿越原平臺次數(shù)數(shù)據(jù)。見表2。

2.3 免疫組化實驗數(shù)據(jù)

不同實驗組小白鼠腦部皮層Aβ在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿表達(dá)，見圖2；不同實驗組小白鼠大腦海馬Aβ在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿表達(dá)，見圖3。鉤藤堿干擾對小白鼠腦部BACE mRNA、AβPP mRNA表達(dá)的影響，見圖4。

2.4 各組小鼠腦部皮層以及海馬淀粉樣蛋白表達(dá)的平均光密度和陽性細(xì)胞數(shù)

以平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)百分比值（單位為%）為研究指標(biāo)，給出的為SAMR1對照組、SAMP8對照組以及huperzine A陽性藥對照組、不同劑量鉤藤堿實驗組大腦皮層Aβ平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)。見表3。

2.5 鉤藤堿對BACE、AβPP mRNA表達(dá)的影響

以不同組別BACE、AβPP mRNA表達(dá)百分比為研究指標(biāo)，給出的是對照組、huperzine A陽性藥對照組、不同劑量鉤藤堿實驗組對BACE、AβPP mRNA表達(dá)的影響相關(guān)數(shù)據(jù)。見表4。

3 討論

3.1 不同實驗組的隱蔽性平臺試驗及小鼠探索性試驗

實驗數(shù)據(jù)顯示，由第1天起，正常老化小白鼠（SAMR1）組的逃避性潛伏期顯著短于快速老化癡呆型小白鼠（SAMP8）。如在第2天時，SAMR1對照組的逃避潛伏期為（48.87±31.59）（表1），明顯短于SAMP8組同一天數(shù)據(jù) （77.88±26.64），具有顯著性差異，表明SAMR1小鼠記憶及學(xué)習(xí)能力較SAMP8強。由表1數(shù)據(jù)所示，從第3天開始，huperzine A陽性對照組（石杉堿甲陽性藥組）及鉤藤堿各用藥組的逃避性潛伏期較快速老化癡呆型小白鼠（SAMP8）明顯縮短，且差異較為顯著。如石杉堿甲陽性藥組第3天逃避潛伏期為（41.14±38.16），同一天鉤藤堿低、中、高劑量組逃避潛伏期數(shù)據(jù)分別為（42.02±26.02），（43.51±25.46），（31.01±12.33），均較同一天SAMP8組數(shù)據(jù)（75.11±26.22），大大減小，表明通過鉤藤堿或石杉堿甲用藥，能較好地改善SAMP8小鼠的記憶及學(xué)習(xí)能力。但鉤藤堿各組與huperzine A陽性組各實驗數(shù)據(jù)差異不顯著（表1）。

第5天撤除平臺，觀察小鼠的空間探索能力，SAMR1對照組（表2）和鉤藤堿組（表2）水下示蹤軌跡基本都處于原來的平臺象限范圍內(nèi)，其次軌跡較多的區(qū)域為原來的平臺臨近的兩側(cè)象限。如表2所示，huperzine A陽性對照組小鼠水下游泳軌跡與SAMR1對照組小鼠軌跡大致相同。但快速老化癡呆型小白鼠（SAMP8）游泳軌跡則基本圍繞Morris水迷宮池壁，且軌跡基本上在各象限具有分布，較為隨機。上述數(shù)據(jù)表明，正常老化小白鼠（SAMR1）組、huperzine A陽性藥對照組和鉤藤堿各實驗組小鼠停留在初始平臺象限的時間以及游泳穿越初始平臺次數(shù)均顯著多于快速老化癡呆型小白鼠（SAMP8）組，顯示正常老化小白鼠和鉤藤堿、石杉堿甲等用藥組小白鼠的記憶及學(xué)習(xí)能力比快速老化癡呆型小白鼠強，揭示本研究用藥：鉤藤堿一定程度上可以提高快速老化癡呆型小白鼠的學(xué)習(xí)能力。

如上所述，在隱蔽平臺試驗中，鉤藤堿各組逃避潛伏期均大大小于SAMP8對照組（表1），顯示喂服鉤藤堿后，SAMP8組小白鼠的記憶能力提高較為顯著。此外，空間探索性實驗表明，鉤藤堿各實驗組小鼠在原平臺象限的停留時間及游泳穿越初始平臺的次數(shù)均大于快速老化癡呆型小白鼠組（SAMP8，表 2），與對照組相比，由傳統(tǒng)中藥鉤藤提取出的鉤藤堿活性成分能使快速老化小白鼠SAMP8保持較長時間記憶能力。

3.2 Aβ免疫陽性神經(jīng)元形態(tài)特征及分布區(qū)域

一般來說，小白鼠腦部皮層及海馬等部位為Aβ免疫陽性神經(jīng)元主要分布區(qū)域。該類神經(jīng)元一般呈現(xiàn)不規(guī)則錐形等。DAB陽性反應(yīng)物顏色為棕黃色，主要定位于細(xì)胞膜、胞漿等部位?？捎^察到陰性細(xì)胞核。此外，通過研究也可以在小鼠腦部細(xì)胞壁觀察到淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積。正常老化小白鼠腦部皮層以及海馬區(qū)域Aβ神經(jīng)元的相關(guān)表達(dá)極少，陽性反應(yīng)物DAB染色后顏色較淺；快速老化癡呆型小白鼠腦部皮層Aβ陽性免疫神經(jīng)元在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿具有廣泛表達(dá)，DAB染色明顯變深（圖2b，圖3b）；與之相比鉤藤堿各劑量組（圖2d、e、f，圖3d、e、f）大腦皮層和海馬區(qū)Aβ免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)降低較為明顯。且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系，鉤藤堿高劑量組（圖2f、圖3f）較鉤藤堿低劑量組（圖2d、圖3d）降低更為明顯。與SAMP8組相比，石杉堿甲陽性藥對照組（圖2c、圖3c）也具有較明顯的降低效應(yīng)。但石杉堿甲陽性藥對照組與鉤藤堿各劑量組數(shù)據(jù)間差異不顯著。

3.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

由表3可見，SAMR1對照組大腦皮層Aβ平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)分別為（0.234±0.042）和（6.95±2.62）（表3）。而對應(yīng)的，SAMP8組皮層Aβ平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)分別為（0.326±0.094） 和（69.91±9.31），顯示SAMP8組大腦皮層淀粉樣蛋白平均光密度以及免疫陽性神經(jīng)元數(shù)均較正常老化小白鼠（SAMR1）組升高。類似的現(xiàn)象也可以在海馬區(qū)觀察到，SAMP8組海馬區(qū)Aβ平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)均較SAMR1對照組升高明顯（表3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

與此同時，與快速老化癡呆型小白鼠組相比，huperzine A陽性對照組和鉤藤堿各用藥組的小鼠腦部平均光密度和免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)降低明顯。表明鉤藤提取物：鉤藤堿能較好地減少淀粉樣蛋白Aβ的平均光密度和陽性細(xì)胞數(shù)。如鉤藤堿中劑量組：海馬區(qū)Aβ平均光密度值為（0.144±0.061）（表3），與SAMP8組對應(yīng)值（0.232±0.048）相比明顯降低，低劑量組、高劑量組也可以觀察到類似現(xiàn)象，顯示鉤藤堿對于減小Aβ平均光密度值和陽性細(xì)胞數(shù)具有較好效果。

3.4 鉤藤堿對BACE、AβPP基因表達(dá)影響研究

如圖4所示，腦內(nèi)β位點APP裂解酶（BACE）、β-淀粉樣蛋白前體（AβPP）及淀粉樣蛋白（Aβ）的PCR擴增產(chǎn)物在156 bp、468 bp和300 bp上下觀察到較為明晰的目的基因以及內(nèi)參基因擴增帶，并與初始設(shè)計的PCR擴增長度吻合，且未觀察到其他PCR擴增產(chǎn)物。經(jīng)分析比對，與快速老化癡呆型小白鼠（SAMP8）組相比，鉤藤堿組的β位點APP裂解酶（BACE）、β-淀粉樣蛋白前體（AβPP）基因表達(dá)水平降低明顯（P<0.05）。例如，鉤藤堿高劑量組：AβPP mRNA表達(dá)值為（84.00±5.03）（表4），與SAMP8組對應(yīng)值（110.11±30.51）（表4）相比明顯降低；鉤藤堿低劑量組、鉤藤堿中劑量組也可以觀察到類似趨勢。此外，與SAMP8組相比，鉤藤堿各組BACE mRNA表達(dá)也有明顯下降（P<0.05，表4），以上效應(yīng)均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，顯示鉤藤堿能減少或抑制Aβ的過度產(chǎn)生，從而改善快速老化癡呆模型小白鼠SAMP8的學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，鉤藤堿對快速老化小白鼠腦組織腦內(nèi)β位點APP裂解酶、β-淀粉樣蛋白前體及淀粉樣蛋白沉積表達(dá)有明顯的抑制作用，提示鉤藤堿改善快速老化小白鼠的學(xué)習(xí)記憶力的作用機制是通過調(diào)節(jié)Aβ通路的表達(dá)等途徑，我們期待本研究對未來阿爾茨海默癥的治療可以扮演重要角色。

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（收稿日期：2015-11-13）