表柔比星、奧沙利鉑和5—Fu對肝癌的凋亡影響

曹園園　李青山

摘要：目的 探討表柔比星（Epirubicin）及聯(lián)合5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑（L-OHP）對人肝癌細胞株HepG2的凋亡的影響。方法 應用MTT法觀察上述藥物單藥應用、兩藥及三藥同時或序貫聯(lián)合應用對細胞HepG2生長的影響，評價藥物聯(lián)合應用的效果。結(jié)果 單藥應用、兩藥聯(lián)合及三藥聯(lián)合應用均對HepG2細胞有顯著的抑制作用（P<0.05）；兩藥聯(lián)合應用均優(yōu)于各自單藥的抑制效果，5-FU聯(lián)合L-OHP弱于5-FU或L-OHP與表柔比星聯(lián)合的抑制效果（P<0.05），由L-OHP到5-FU小劑量序貫聯(lián)合具有明顯的協(xié)同作用；三藥聯(lián)合應用的抑制效果顯著優(yōu)于兩藥聯(lián)合（P<0.05），由表柔比星+L-OHP到表柔比星+5-FU的序貫聯(lián)合應用與三藥同步聯(lián)合應用無顯著性差異（P>0.05），但由表柔比星+5-FU到表柔比星+L-OHP序貫應用時明顯低于三藥同步應用的效果（P<0.05），且三藥全量及半量聯(lián)合應用效果差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論 表柔比星+L-OHP序貫到+5-FU的聯(lián)合應用具有高效協(xié)同抑制人肝癌細胞株HepG2的作用。

關鍵詞：表柔比星；奧沙利鉑；氟尿嘧啶；細胞株HepG2

1 資料與方法

1.1細胞 細胞株HepG2 上海美軒生物。將細胞株置于10%胎牛血清RPMI1640（美國GIBCO）培養(yǎng)液（內(nèi)含0.1%青霉素、鏈霉素），并于培養(yǎng)箱37℃、5%二氧化碳內(nèi)培養(yǎng)。

1.2藥物 表柔比星：浙江海正藥業(yè)；5-氟尿嘧啶：上海旭東海普；奧沙利鉑：江蘇恒瑞。

1.3用MTT法檢測藥物對細胞的促凋亡作用 將對數(shù)生長期制成細胞懸液，濃度為2×105個/mL，并置于96孔板內(nèi)培養(yǎng)，每孔200ul，加人藥物20ul。并分組：空白組、對照組和藥物實驗組，5-FU為9.375ug/ml、18.75ug/ml、37.5ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml；L-OHP為0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5

mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml、8.0mg/ml表柔比星為2.5ug/ml。根據(jù)SPSS17.0回歸分析IC30，藥物濃度為藥物的IC30，有研究證實以抑制率大于30%為最佳敏感界值。

1.4藥物聯(lián)合作用 篩選出5-FU的IC30為84.0ug/ml，L-OHP的IC30為86.4ug/ml。采用5-FU的終濃度為84.0ug/ml（全量）和42.0ug/ml（半量）L-OHP的終濃度為86.4ug/ml（全量）和43.2ug/ml（半量）。藥物實驗組又分為：①單藥組5-FU（全量84.0ug/ml和半量42.0ug/ml）、L-OHP（全量86.4ug/ml和半量43.2ug/ml）、表柔比星（2.5ug/ml）；②兩藥聯(lián)合組，包括兩藥同步化療（5-FU+LOHP、5-FU+表柔比星、L-OHP+表柔比星）和兩藥序貫化療（5-FU84.0ug/ml→L-OHP86.4ug/ml、5-FU42.0ug/ml→LOHP43.2ug/ml、L-OHP 86.4ug/ml→5-FU 84.0ug/ml、L-OHP43.2ug/ml→5-FU42.0ug/ml）；③三藥聯(lián)合組，包括三藥同步化療（5-FU 84.0ug/ml+L-OHP86.4ug/ml+表柔比星、5-FU42.0ug/ml+L-OHP43.2ug/ml+表柔比星）和三藥序貫化療（表柔比星+5-FU84.0ug/ml→表柔比星+L-OHP86.4ug/ml、表柔比星+L-OHP86.4ug/ml→表柔比星+5-FU84.0ug/ml、表柔比星+5-FU42.0ug/ml→表柔比星+L-OHP43.2ug/ml、表柔比星+ L-OHP43.2ug/ml→表柔比星+5-FU 42.0ug/ml）。每一個組都設計為四個復孔。單藥組直接加入各濃度藥物100ul；兩藥同步聯(lián)合時采用1：1方案，將藥物濃縮一倍，后各加50ul。這樣每一孔內(nèi)的藥物濃度、體積和總量未發(fā)生改變；三藥同步聯(lián)合時，應用1：1：1方案，先將藥物濃縮2倍，再各加25ul，同樣為保證藥物濃度和總量不變，之后應補加25ul的培養(yǎng)基。序貫化療時，細胞株按著序貫方案中的順序先接受前一種藥物持續(xù)作用24h，之后小心棄除含藥培養(yǎng)液， 加入含后一種化療藥物的培養(yǎng)液，并持續(xù)作用24h，期間保持培養(yǎng)液總量不發(fā)生變化。置于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）培養(yǎng)48h后，離心棄上清，加入200ul不含血清的培養(yǎng)液及20ul 5mg/mlMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后再棄去培養(yǎng)液，加人200ul DMSO，并振蕩5min后用自動酶標讀數(shù)儀測OD值，進行藥物作用效應計算。

抑制率 =[（對照組吸光值（A）-實驗組吸光值（A））÷對照組吸光值（A）]×100%。

1.5兩藥聯(lián)合療效評價 采用fractional productconcept（fp值）[3]來評價兩藥相互作用的性質(zhì)，fp值：I1+2/（I1+I2-I1*I2），其中I1+2：兩藥聯(lián)合作用平均抑制率，I1和I2：兩藥單獨作用平均抑制率； fp值>1，兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同；fp值=1，兩藥作用性質(zhì)為相加；fp值<1，兩藥作用性質(zhì)為拮抗。

1.6統(tǒng)計學方法 用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果資料采用方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 5-FU、L-OHP對肝癌細胞HepG2的抑制作用 通過測定稀釋至不同梯度濃度的5-FU和L-OHP對細胞株HepG2生長的抑制作用，得出兩種藥物對HepG2的IC50值約為228.940ug/ml、2737.328ug/ml。

2.2表柔表星、5-FU及L-OHP不同方式的聯(lián)合用藥對肝癌細胞HepG2的抑制作用。

2.2.1單藥對肝癌細胞株HepG2的作用 表柔比星、5-FU及L-OHP單獨作用時，均能顯著的抑制肝癌細胞HepG2的生長（P<0.01）；且5-FU、L-OHP全量作用時抑制作用明顯優(yōu)于半量藥物的作用（P<0.05）。見表1。

2.2.2兩種藥物以不同序貫聯(lián)合順序應用時對HepG2的生長抑制作用 各組藥物都可以有效抑制肝癌細胞HepG2（P<0.01），其中兩藥聯(lián)合優(yōu)于單藥（P<0.01），且全量效果優(yōu)于半量（P>0.05）；5-FU+表柔比星組對細胞株HepG2的抑制作用優(yōu)于5-FU+L-OHP組（P<0.05）。兩藥同步時，5-FU+表柔比星表現(xiàn)了較好的協(xié)同作用，而L-OHP+表柔比星組則顯示出拮抗作用。5-FU與L-OHP同步化療時，各組均有顯著的抑制作用（P<0.01），但不同聯(lián)合組之間的抑制作用無統(tǒng)計學差異（P>0.05），5-FU聯(lián)合表柔比星的作用效果優(yōu)于5-Fu聯(lián)合L-OHP（P<0.05）。關于不同劑量和順序的5-Fu及L-OHP的序貫化療，半量L-OHP→半量5-FU兩藥的序貫聯(lián)合具有協(xié)同作用，其余序貫聯(lián)合均表現(xiàn)為拮抗。見表2。

2.2.3 5-FU、L-OHP及表柔比星三藥聯(lián)合應用 三種藥物共同作用于肝癌細胞HepG2時，能明顯的降低其生存率（P<0.001），且較所有其他組合效果更優(yōu)；三藥聯(lián)合時，不同劑量的藥物作用的細胞抑制率無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；在三藥不同序貫聯(lián)合時，表柔比星+L-OHP→表柔比星+5-FU與同步聯(lián)合比較無顯著性差異（P>0.05），且均顯著高于表柔比星+5-FU→表柔比星+L-OHP序貫組（P<0.05）。見表3。

3 討論

肝癌的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)不斷升高，運用多種治療手段綜合治療是肝癌目前的主要治療原則。化療在晚期肝癌治療中占據(jù)重要地位，但由于肝癌細胞對化療藥物不敏感及耐藥的問題，使得肝癌的化療效果不理想。目前，經(jīng)研究證實較為有效的藥物有多柔比星類、5-FU類、鉑類。其中多柔比星在肝癌的治療中效果最優(yōu)，有研究證實表柔比星與其效果相近，它們均屬于抗生素類抗腫瘤藥。奧沙利鉑屬新合成的3代鉑類藥物，與5-Fu有協(xié)同作用，以兩種藥物為主的FOLFOX4化療方案已于2011年被我國原發(fā)性肝癌診療規(guī)范推薦用于肝癌的姑息治療中。將以上三種藥物應用于本實驗中，通過觀察它們不同聯(lián)合及序貫應用時的最大抑制率，以篩選出最優(yōu)的聯(lián)合方案，為臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。

本實驗中我們探討了不同劑量的5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑分別與表柔比星組成的不同的聯(lián)合或序貫方案對細胞抑制率的影響，從中可以看到含表柔比星組的兩藥聯(lián)合方案的抑制作用顯著高于不含表柔比星組，表明與含表柔比星的聯(lián)合方案相比，5-氟尿嘧啶聯(lián)合奧沙利鉑并未顯示明顯的優(yōu)勢。另外在三藥聯(lián)合應用時對細胞的抑制率達到最高，表明三藥聯(lián)合相對于單藥、兩藥而言為效果最優(yōu)的化療方案。并且表柔比星同步奧沙利鉑到表柔比星同步氟尿嘧啶時的序貫聯(lián)合與三藥同步聯(lián)合時比較差異無統(tǒng)計學意義，表明此種序貫不僅沒有降低療效，而且同樣可以達到三藥同步時的藥效，為臨床尋找最優(yōu)的序貫方案提供一定的實驗依據(jù)。另外當存在藥物劑量（全量、半量）不同時，其結(jié)果比較差異亦無統(tǒng)計學意義，表明全量應用與半量應用的療效相當，所以在保證療效不變的前提下，可以降低劑量，從而降低藥物的毒副作用，使其能更好的應用于臨床。

由上述得出，表柔比星+L-OHP到表柔比星+5-FU的序貫聯(lián)合應用具有高效協(xié)同抑制人肝癌細胞株HepG2 的作用， 可以作為臨床應用的實驗依據(jù)，并為肝癌患者的化療及小劑量序貫化療提供參考。但本實驗為體外干預實驗，其結(jié)果有待于進一步的臨床驗證。

參考文獻：

[1]高勇，劉揚清，易竹筠， 等.伊立替康、奧沙利鉑及氟尿嘧啶對人大腸癌LoVo細胞株作用的實驗研究[J].臨床腫瘤學雜志，2008，13（3）：217-221.

[2]劉家賀.于全成 奧沙利鉑聯(lián)合表柔比星經(jīng)導管肝動脈化療栓塞介入治療原發(fā)性肝癌臨床分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2014，30（05）：743-744.

[3]馬瑜瑾，李世朋.沙利度胺對肝癌細胞HepG2化療的增敏作用[J].中國臨床藥理學雜志， 2014（07）：597-600.

[4]awada A， Chiba T， Ooka Y， et al.Transarterial chemoembolization with miriplatin plus？epirubicin in pationts with hepatocellular carcinoma[J].ANticancer Res，2015，35（1）：549-554.

[5]Lee JE， Bae SH， Choi JY， et al.Epirubicin，cisplatin，5-Fu combination chemotherapy in sorafenib-refractory metastatic hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol，2014，20（1）：235-241.

編輯/哈濤