淺談CRISPR/Cas9技術(shù)在基因工程中的應(yīng)用

吳紅玉

2014年11月28日，全球權(quán)威科學(xué)雜志《Science》在線發(fā)表綜述文章，描述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展歷史并肯定其應(yīng)用.眾所周知，生物的遺傳信息儲(chǔ)存在基因中，特定的編碼基因決定特定的蛋白質(zhì).當(dāng)基因發(fā)生突變的時(shí)候，由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸組成以及三維構(gòu)象往往會(huì)同樣發(fā)生改變，有些蛋白甚至提前終止，從而導(dǎo)致遺傳疾病的發(fā)生.因此，對(duì)于基因組做出特異性的靶點(diǎn)修飾，是治療人類遺傳疾病的可行方法.通過對(duì)遺傳學(xué)的位點(diǎn)修飾的探究，科學(xué)家們?cè)诩?xì)菌和古細(xì)菌中找到了一種新的RNA，該RNA起著地址標(biāo)記的指導(dǎo)作用，被命名為gRNA.gRNA和CRISPR/Cas9蛋白相互作用，確保切割發(fā)生在基因組的確切位置.通過科學(xué)工作者的合作和研究，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被不斷的簡(jiǎn)化使其變成現(xiàn)在的通用技術(shù).

一、CRISPR的發(fā)展歷程

1985年，日本大阪大學(xué)學(xué)者發(fā)表堿性磷酸酶基因的研究性篇論文，該發(fā)現(xiàn)涉及編碼基因附近存在的小的DNA片段.之后有三個(gè)獨(dú)立的生物信息學(xué)團(tuán)隊(duì)作出報(bào)告，他們的研究均暗示CRISPR在微生物免疫中有可能發(fā)揮了作用，他們?cè)趫?bào)告中指出了間隔區(qū)DNA與噬菌體的基因序列通常高度匹配.2007年，科學(xué)家通過研究發(fā)現(xiàn)，添加或刪除和噬菌體DNA相匹配的間隔區(qū)DNA會(huì)改變嗜熱鏈球菌對(duì)噬菌體攻擊的抵抗力，這是對(duì)間隔區(qū)DNA功能的巨大突破.2011年科研工作者開始嘗試解析各種與CRISPR相關(guān)的蛋白質(zhì)的功能，最終分離出了Cas9蛋白質(zhì)的CRISPR系統(tǒng)，這一發(fā)現(xiàn)為研究間隔區(qū)DNA如何在細(xì)菌的免疫防御中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.2013年初，《Science》雜志公布了兩項(xiàng)最新研究成果，首次證明了Cas9 核酸酶可以對(duì)小鼠和人類細(xì)胞進(jìn)行有效的編輯，是更為安全的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組編輯的新方法.如今，科研工作者能夠通過設(shè)計(jì)gRNA，靶向包括果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠和人類等在內(nèi)的許多物種的基因組中的幾乎任何堿基序列，實(shí)現(xiàn)真正的基因工程的遺傳編輯.

CRISPR系統(tǒng)從初發(fā)現(xiàn)到2013年的系統(tǒng)建立實(shí)現(xiàn)了在多個(gè)物種中的應(yīng)用，并將在更多的物種中得到應(yīng)用.

二、CRISPR的工作原理

雖然科學(xué)家到目前為止還沒有完成弄清楚CRISPR-Cas/Cas9 系統(tǒng)的詳細(xì)作用機(jī)制， 但已基本明確了該系統(tǒng)的作用過程.目前大家比較公認(rèn)的該系統(tǒng)的作用機(jī)制大體可分為以下3個(gè)不同的階段，如圖2.

噬菌體侵入宿主時(shí)，首先產(chǎn)生編碼蛋白，這個(gè)過程由Cas/Cas9基因完成.編碼蛋白產(chǎn)生后靶向調(diào)節(jié)間隔序列.此后，基因組中被靶向的間隔序列被剪切，整合到宿主基因組的5′端.短的參入間隔序列被轉(zhuǎn)錄為crRNAs.最后，在CAS蛋白復(fù)合物的參與下，靶向干擾噬菌體的基因組序列.

三、Cas9的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

雖然CRISPR/Cas9被發(fā)現(xiàn)的歷史并不長(zhǎng)，但其在工業(yè)和學(xué)術(shù)領(lǐng)域方面的應(yīng)用已經(jīng)非常的廣泛.

首先，CRISPR/Cas9的特性被用于不同菌株分類.由于Cas9蛋白的來源是細(xì)菌來源，所以要使得Cas9蛋白在不同動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)高效轉(zhuǎn)運(yùn)，需要在蛋白上添加真核細(xì)胞的核定位序列.科學(xué)家通過改造Cas9使得多系統(tǒng)都能夠進(jìn)行CRISPR/Cas9應(yīng)用.

此外，相比于遺傳學(xué)中常用的ZFN和TALEN兩種人工核酸酶，CRISPR/Cas9憑借其可以造成特異性的單鏈切口，激活細(xì)胞的同源重組機(jī)制的特點(diǎn)因而具有極大的優(yōu)勢(shì).同時(shí)，對(duì)CRISPR/Cas9進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)修飾方法，實(shí)現(xiàn)大片段缺失的突變改造機(jī)制.這就為困擾人類多年的遺傳疾病的治療帶來了一線曙光.通過科學(xué)家的努力，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)能夠精確編輯小鼠和大鼠基因組特定的基因位點(diǎn)，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于大小鼠基因的敲除和過表達(dá)的模型制備.Cas9在科研工作中的突破性貢獻(xiàn)，為無數(shù)科學(xué)工作者提供了敲除的平臺(tái)以便更好的研究.

教科書上已經(jīng)對(duì)1997年體細(xì)胞克隆多利羊的報(bào)道做出了“突破性進(jìn)展”的評(píng)述.然而轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物由于技術(shù)和輿論壓力仍然不為所有人接受.而如果充分利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，則有可能使這一局面得到改觀.比如有科研小組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)修飾豬等家畜的基因組，通過CRISPR/Cas9修飾影響家畜生產(chǎn)的基因單核苷酸多態(tài)性，從而可以提高豬肉瘦肉率、綿羊肌肉含量等.此外，CRISPR/Cas9在干細(xì)胞研究中也有著應(yīng)用.

四、Cas9獲得的榮譽(yù)

新技術(shù)CRISPR/Cas9，被稱為“DNA 剪刀”或“基因剪刀”.這項(xiàng)科研的重要意義在于可以為人類的健康謀福祉.自 2012年6月首度亮相之后，獲得了許多科學(xué)家的認(rèn)可，在數(shù)個(gè)國際會(huì)議上備受推崇，為基因治療和遺傳疾病的研究拓展了思路，提供了全新的治療策略.眾所周知，人類有許多疾病，例如鐮刀型細(xì)胞貧血癥、糖尿病、愛滋病、抑郁癥等，都與基因有關(guān).人們廣泛利用 Cas9技術(shù)，從基因的源頭上探究這些疾病發(fā)病的根源，嘗試找出新的標(biāo)靶藥物，達(dá)到治愈疾病的目的.新技術(shù)CRISPR/Cas9甚至還可以應(yīng)用于改造酵母菌，讓其來生產(chǎn)生物燃料，從而緩解人類的能源危機(jī)；應(yīng)用于改造小麥，使其能抵抗害蟲和干旱天氣，緩解人類的糧食危機(jī).美國著名教授 Jonathan Weissman 稱：“ CRISPR/Cas9技術(shù)徹底改變游戲規(guī)則，現(xiàn)在我們可隨意啟動(dòng)或關(guān)閉遺傳因子.”

五、展望

回首生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)程，能夠真正推進(jìn)人類科學(xué)的研究皆基于探究自然科學(xué)的奧秘.CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)為DNA提供了安全可行的基因剪刀，避免人們因?yàn)橥庠椿驅(qū)牖虿徽?dāng)基因編輯而引起恐慌.隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的完善建立，該技術(shù)將越發(fā)普及，用于解決人類面臨的疾病，食物安全等問題，為科研事業(yè)的推進(jìn)提供了巨大的平臺(tái).