miR—140與膝關節(jié)骨性關節(jié)炎嚴重程度的相關性

鄧黃河　陳志偉

【摘要】 目的：探析miR-140與膝關節(jié)骨性關節(jié)炎嚴重程度的相關性。方法：選擇本科收治的膝關節(jié)骨性關節(jié)炎患者60例為骨性關節(jié)炎組（OA組），按LawrenceX線診斷標準，Ⅰ～Ⅳ級患者各15例。同時選取同期非骨性關節(jié)炎患者30例為對照組（主要為外傷患者）。應用實時熒光定量（PCR）檢測上述兩組患者膝關節(jié)液中miR-140的含量。比較兩組及不同等級患者的miR-140表達水平。結(jié)果：OA組miR-140表達水平顯著低于對照組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；miR-140表達水平隨OA嚴重程度增加而降低，比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)論：miR-140表達水平與膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的嚴重程度呈負相關。

【關鍵詞】 臨床觀察； 膝關節(jié)骨性關節(jié)炎； miR-140

【Abstract】 Objective：To study the correlation of miR-140 with the severity of knee osteoarthritis.Method：60 patients with knee osteoarthritis were selected as the OA group.According to Lawrence X-ray diagnosis standard，there were 15 cases from level Ⅰ to level Ⅳ respectively.30 cases without OA were selected as the control group at the same time（they were mainly trauma patients）.Through real-time fluorescence quantification，the content of miR-140 in the two groups was detected.The expression levels of miR-140 in the two groups and patients of different degrees were compared.Result：The expression level of miR-140 in the OA group was significantly lower than that in the control group，the difference was statistically significant（P<0.01）.The expression level of miR-140 was reduced according with the increasing of the severity of knee osteoarthritis，the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion：The expression level of miR-140 is negatively correlated with the severity of knee osteoarthritis..

【Key words】 Clinical observation； Knee osteoarthritis； miR-140

First-authors address：The Peoples Hospital of Xuwen County，Xuwen 524100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.07.001

骨性關節(jié)炎（OA）是一種慢性關節(jié)病，典型特征為骨質(zhì)增生，關節(jié)軟骨破壞、變性等，多見于老年患者[1]。隨著我國人口老齡化的加劇，OA的發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升的趨勢。該病發(fā)病率隨年齡的增長而增加，特別是55歲之后OA發(fā)病率明顯增加。OA的發(fā)病確切機理目前仍不十分清楚。近年來，有研究顯示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨關節(jié)炎的發(fā)病中起著關鍵作用。已有研究證明，對miR-140的編碼基因定向敲除，小鼠可發(fā)生與年齡相關的膝關節(jié)骨性關節(jié)炎樣改變，如關節(jié)軟骨的纖維化、缺失蛋白多糖等[2]。為深入探究人OA及miR-140的相關性的機制，且初步分析下游靶基因的生物信息，筆者對不同分級OA患者的膝關節(jié)液進行實時熒光定量PCR檢測miR-140表達水平，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本科收治的膝關節(jié)骨性關節(jié)炎患者60例為關節(jié)炎組（OA組），按LawrenceX線診斷標準[3]：Ⅰ～Ⅳ級患者各15例。Ⅰ級患者中男

9例，女6例，年齡27～75歲，平均（41.3±4.5）歲；

Ⅱ級患者中男8例，女7例，年齡27～75歲，平均（41.2±4.4）歲；Ⅲ級患者中男10例，女5例，年齡27～75歲，平均（41.4±4.4）歲；Ⅳ級患者中男10例，女5例，年齡27～75歲，平均（41.4±4.3）歲。同時選取同期非骨性關節(jié)炎患者30例為對照組（主要為外傷患者），其中男20例，女10例，年齡27～75歲，平均（41.5±4.2）歲，各組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）標本收集及保存：關節(jié)液分離，即采用無酶、無菌的15 mL離心管采集3～4 mL符合實驗的膝關節(jié)液，室溫環(huán)境下離心5 min，

3000 r/min，小心吸取上清液，在1.5 mL規(guī)格的EP管內(nèi)分裝，-80 ℃置存。（2）提取總RNA：進行TRhol一步法提取，主要為裂解、分層、沉淀RNA、洗滌RNA、溶解RNA等步驟。（3）CDNA反轉(zhuǎn)錄：采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptionit和TaqMan MicroRNAAssays試劑盒中特異性的莖-環(huán)狀反轉(zhuǎn)錄引物，進行反轉(zhuǎn)錄反應，反應在Applied Biosystems 2700熱循環(huán)儀上進行，配置反應液的所有操作均在冰上進行。反應體系見表1。反應條件：16 ℃ 0.5 h，42 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min。選擇總RNA標本：OD260/280值為1.6～2.1。總RNA反應量為100 ng/次。（4）實時熒光定量PCR反應：應用上述TaqMan MicroRNAAssays試劑盒中的PCR引物探針混合液進行PCR擴增及熒光檢測。在美國Applied Biosystems公司StepOneTM熒光定量PCR儀上進行反應。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s及60 ℃ 1 min，后兩步共循環(huán)50次。PCR產(chǎn)物電泳：應用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，60 V，40 min。生物信息分析：進行Targetscan分析預測miR-140下游靶基因。

1.3 統(tǒng)計學處理 本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗或秩和檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

OA組的miR-140表達水平為（0.8±0.5），對照組的miR-140表達水平為（2.7±1.2），OA組的miR-140表達水平顯著低于對照組，比較差異有統(tǒng)計學意義（t=11.32，P<0.01）；OA嚴重程度Ⅰ級miR-140表達水平為（2.3±0.9），Ⅱ級miR-140表達水平為（1.8±0.7），Ⅲ級miR-140表達水平為（1.5±0.6），Ⅳ級miR-140表達水平為（0.8±0.4），miR-140表達水平隨OA嚴重程度增加而降低，比較差異有統(tǒng)計學意義（F=5.90，P<0.01）。預測has-miR-140-5P的靶基因，結(jié)果有251種靶基因，與OA相關的靶基因有轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，見圖1。

3 討論

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的整個疾病過程不僅影響到關節(jié)軟骨，還涉及整個關節(jié)，包括軟骨下骨、韌帶、關節(jié)囊、滑膜及關節(jié)周圍肌肉。膝關節(jié)骨性關節(jié)炎主要見于老年人，OA導致的痛苦和殘疾嚴重損害了患者的生活質(zhì)量，并成為最嚴重的社會經(jīng)濟負擔之一。膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種；原發(fā)性骨性關節(jié)炎又稱特發(fā)性骨性關節(jié)炎，多見于體力勞動者、血壓高者及女性、超過50歲、體型肥胖者；而繼發(fā)性膝關節(jié)骨性關節(jié)炎又稱創(chuàng)傷性關節(jié)炎，常繼發(fā)于關節(jié)畸形、關節(jié)損傷、關節(jié)炎癥或其他傷病。目前，大多數(shù)研究認為可能和患者的遺傳易感性、肥胖、骨質(zhì)疏松、外傷等因素有關[4]。有研究顯示，不同種族之間OA的發(fā)病率存在一定的差異，例如髖關節(jié)骨性關節(jié)炎在高加索人種中較為多見，在我國及其他有色人種中較為少見[5]。同時OA存在明顯的家族聚集性，這樣的結(jié)果也說明其發(fā)生與遺傳存在一定的相關性；肥胖患者OA的發(fā)病率顯著上升，提示超重可能是OA發(fā)病的誘因[6]；骨質(zhì)疏松者OA的發(fā)生率顯著增高，可能與軟骨下骨小梁變薄、變僵硬時，其承受壓力的耐受性就減少有關；創(chuàng)傷造成局部骨質(zhì)破壞、缺血等，造成骨營養(yǎng)不良，炎癥細胞浸潤等因素可能導致OA的發(fā)生明顯增加。OA的發(fā)病確切機理目前仍不十分清楚[7]。近年來，有研究顯示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨關節(jié)炎的發(fā)病中起著關鍵作用[8-9]。

本研究探析miR-140與膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的嚴重程度的相關性，結(jié)果顯示OA組的miR-140表達水平顯著低于對照組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；miR-140表達水平隨OA嚴重程度增加而降低，比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），膝關節(jié)骨性關節(jié)炎嚴重程度與miR-140表達水平呈負相關，與Miyaki等[10]的研究結(jié)果大體一致，膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病變中心是軟骨損傷；疾病的第一征象為膠原纖維支架的分離，破損軟骨承受應力的能力降低，導致軟骨下骨承受相對較低的應力而發(fā)生微骨折，修復后的骨組織失去正常的彈性，引發(fā)關節(jié)軟骨的進一步損傷[11-12]；軟骨基質(zhì)蛋白多糖生物合成和分解異常，軟骨細胞無法合成正常的具有長鏈結(jié)構的透明質(zhì)酸和聚氨基葡萄糖，由此產(chǎn)生的短鏈蛋白多糖聚合物由膠原網(wǎng)狀結(jié)構中溢出，導致關節(jié)軟骨局部軟化、失去彈性、磨損及結(jié)構破壞；繼發(fā)反應有超氧化物自由基、膠原酶和磷脂酶的激活，進一步導致軟骨的損傷并引發(fā)關節(jié)相鄰骨骼的骨性關節(jié)炎反應[13]；miR-140micRNAs的家族成員為miR-140，某些軟骨中可表達miR-140，且可對軟骨發(fā)育進行調(diào)節(jié)，軟骨組織中特異性表達miR-140且其表達水平的改變可致病[14]。軟骨細胞中可生成成熟的miR-140，在膝關節(jié)骨性關節(jié)炎中表達水平下降可能源于膝關節(jié)骨性關節(jié)炎患者的軟骨細胞出現(xiàn)病理性變化，生成miR-140下降；可影響Dicer酶及Drosha酶活性的因素引發(fā)miR-140生成減少；OA患者軟骨細胞出現(xiàn)凋亡，引發(fā)miR-140降解；OA病情進展促進miR-140的降解因素的增加，miR-140抑制降解因素下調(diào)，miR-140表達水平減低。同時有研究發(fā)現(xiàn)，PDGF受體中含有負性調(diào)節(jié)作用的miR-140結(jié)合位點，miR-140基因可通過PDGF信號途徑調(diào)節(jié)PDGF受體蛋白水平，表明miR-140與軟骨的發(fā)育密切相關。miR-140在體內(nèi)平衡及軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，對miR-140目標基因的敲除，建立動物實驗模型，研究結(jié)果顯示，miR-140可以對軟骨的發(fā)育進行調(diào)節(jié)，miR-140缺失引發(fā)關節(jié)軟骨的纖維化及蛋白多糖的丟失符合年齡相關的膝關節(jié)骨性關節(jié)炎樣變化[15-16]。綜上所述，miR-140表達水平與膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的嚴重程度呈負相關。

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（收稿日期：2015-10-08） （本文編輯：王利）