參竹心康湯對(duì)慢性心衰大鼠心肌纖維化及Smad2的影響

曹丕鋼 喻正科 高欣 王國(guó)倩

摘要：目的 觀察參竹心康湯對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的干預(yù)效果，并與卡托普利比較，探討參竹心康湯對(duì)慢性心力衰竭心肌纖維化的影響及相關(guān)機(jī)制，以期為評(píng)價(jià)中藥對(duì)慢性心力衰竭的療效及研究提供一客觀依據(jù)，并為參竹心康湯的進(jìn)一步深入研究和市場(chǎng)推廣奠定理論基礎(chǔ)。方法 72只SD大鼠隨機(jī)分為六組：假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組，每組12只。采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作心衰大鼠模型。造模成功后，假手術(shù)組、模型組以蒸餾水10ml/kg灌胃，卡托普利組以卡托普利混懸液7.8mg/kg灌胃，小劑量組、中劑量組、大劑量組分別以中藥煎液11g/kg、22g/kg、44g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃8w。放射免疫法檢測(cè)大鼠心肌Smda2水平、堿水解法檢測(cè)心肌組織羥脯氨酸（HYP）含量。結(jié)果 模型組Smad2與HYP 水平明顯高于假手術(shù)組，卡托普利組、 參竹心康湯組上述指標(biāo)均明顯低于模型組。結(jié)論 參竹心康湯有抗慢性心力衰竭心肌纖維化的作用，其機(jī)制可能與抑制Smad2表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：慢性心力衰竭；心肌纖維化；Smad2；參竹心康湯

慢性心力衰竭（CHF）是由于各種器質(zhì)性或者功能性心臟疾病損害心室充盈或射血功能的一組綜合征，是多種心血管疾病的嚴(yán)重階段[1]，也是多數(shù)器質(zhì)性心臟病患者難以避免的結(jié)局[2]。隨著生活質(zhì)量的改善和人口老齡化的進(jìn)展，CHF的患病人數(shù)也日益增加，給國(guó)家和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。CHF的患病率和死亡率很高并正在逐年增加[3]，其對(duì)社會(huì)的影響也相當(dāng)大，因此積極探討心衰的治療，發(fā)揮中醫(yī)藥的作用勢(shì)在必行。

目前認(rèn)為CHF是一種細(xì)胞因子參與的神經(jīng)內(nèi)分泌過度激活的臨床綜合征，心室重塑是導(dǎo)致心力衰竭的基本機(jī)制[4]，心室重塑包括心肌肥厚和心肌間質(zhì)纖維化，心肌纖維化（MF）和CHF有著密切的聯(lián)系，已成為心衰治療的新靶標(biāo)[5]。

參竹心康湯是筆者多年臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，其前期研究已證明參竹心康湯能有效的治療CHF[6]，其治療CHF的機(jī)制是否和抗心肌纖維化有關(guān)，及其抗心肌纖維化的效果和可能的機(jī)制還未行相關(guān)研究，故現(xiàn)擬通過參竹心康湯治療CHF大鼠，以腹主動(dòng)脈縮窄法（AAC）復(fù)制大鼠心力衰竭模型，以羥脯氨酸（HYP）為檢測(cè)MF的指標(biāo)，探討參竹心康湯對(duì)Smad2的影響，明確依據(jù)益氣養(yǎng)陰、活血化瘀法組方的參竹心康湯對(duì)慢性心力衰竭心肌纖維化的療效及相關(guān)機(jī)制，以期為評(píng)價(jià)中藥對(duì)CHF的療效及研究提供一客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠72 只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（220±10）g。購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（湘）2013-0004，動(dòng)物合格證號(hào)（006737）。常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2主要藥品 參竹心康湯：黨參20g、麥冬10g、黃芪20g、五味子6g、玉竹15g、丹參20g等。中藥飲片由我院附屬醫(yī)院按照2010年《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定購(gòu)入，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科制備成含生藥4.5g/ml的中藥煎液，自然冷卻后置于4℃冰箱冷藏備用?？ㄍ衅绽汉舷嫜胖扑幱邢薰荆?hào)為20130024。購(gòu)置卡托普利片后研磨成極細(xì)粉末，加入蒸餾水中制備成濃度為3.25mg/ml的混懸液，然后置于4℃冰箱冷藏備用。

1.3主要試劑和儀器 大鼠Smad2試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。Hyp試劑盒：南京建成生物工程研究所。紫外分光度計(jì)： 購(gòu)自美國(guó)UVP公司。水平電泳儀（GE-100型）： 杭州大和熱磁電子有限公司。電子天平（FA型）：上海臺(tái)之衡電子衡器有限公司。高速微型離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。NABILA175型低溫冰箱：日本松下電器公司產(chǎn)品。

1.4分組和模型建立 所有實(shí)驗(yàn)大鼠在湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，隨機(jī)分為六組：假手術(shù)組，模型組，卡托普利組，參竹心康湯低、中、高劑量組，每組12只。參照文獻(xiàn)方法[7]，采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作心衰大鼠模型。大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹部手術(shù)區(qū)備皮、消毒并鋪一次性無菌紗布，從劍突下腹正中切開皮膚，切口長(zhǎng)約3cm，分層打開腹腔，在腎動(dòng)脈分支以上5mm處鈍性游離腹主動(dòng)脈，將7號(hào)注射器針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和注射器一同結(jié)扎，然后緩慢將注射器撤出，關(guān)腹，分層縫合，使大鼠腹主動(dòng)脈直徑縮窄為0.7mm。假手術(shù)組開腹后將手術(shù)絲線穿過腹主動(dòng)脈，除不縮窄腹主動(dòng)脈外，其他操作與模型組完全相同。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)6w后，開始出現(xiàn)明顯心力衰竭癥狀，如呼吸頻率和幅度增加，活動(dòng)明顯減少，飲食減少，毛發(fā)干枯無光澤，爪背紫紺，尿少水腫等。造模后大鼠各組分別死亡1、3、2、3、3、3只。于造模成功后，各組大鼠開始灌胃給藥，其中假手術(shù)組、模型組以蒸餾水10mL/kg灌胃，卡托普利組予卡托普利混懸液7.8mg/kg，參竹心康湯低劑量組、中劑量組、高劑量組分別以參竹心康湯中藥煎液11g/kg、22g/kg、44g/kg。以上各藥物組再用蒸餾水稀釋成等體積10mL/kg灌胃，1次/d，連續(xù)給藥8w。

1.5心肌組織Smad2測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，于最后一次給藥后禁食12h，用3%戊巴比妥鈉（45mg/kg）行腹腔注射，大鼠麻醉滿意后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，切取左室長(zhǎng)軸中點(diǎn)水平約5mm厚的心肌組織，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，PBS液清洗，組織剪碎，加入PBS液，制成組織勻漿，置于-20℃冰箱過夜。檢測(cè)前經(jīng)2次反復(fù)凍融以破壞細(xì)胞膜，離心，取上清檢測(cè)，取出酶標(biāo)包被板，標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)孔中先加入大鼠心肌勻漿上清，然后再加樣本稀釋液，空白對(duì)照孔不加試劑，溫育30min，洗板，每個(gè)孔中加入酶標(biāo)工作液，空白對(duì)照孔不加，溫育30min，洗板，顯色，終止，測(cè)定，計(jì)算。

1.6心肌組織HYP測(cè)定 采用堿水解法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中羥脯氨酸的含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，按上述方法取心肌組織，用手術(shù)剪剪碎后放入試管中水解，將各試管用流水冷卻，冷卻后加入PH調(diào)節(jié)液，使PH值在6.0～6.8，向各試管中加入蒸餾水至10ml，然后取4ml稀釋的水解液，在其中加入30mg活性炭，搖晃試管使混和均勻，放入離心機(jī)中，以3500轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速離心10min，若離心后上清液為澄清無色，則說明離心成功，最后小心吸取上清液1.0ml用來檢測(cè)。受檢測(cè)玻璃試管置于水浴箱內(nèi)水浴水解，自然冷卻后，以3500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10min，離心后取上清液，以蒸餾水調(diào)零，用分光光度計(jì)在550nm處，1cm光徑，測(cè)定各試管的吸光度。按以下公式計(jì)算HYP含量（μg/mg濕重）：（測(cè)定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)管含量5μg/ml×水解液總體積（10ml）/組織濕重（mg）。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，各組間的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1心肌組織HYP變化 與假手術(shù)組比較，模型組、卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組心肌組織HYP含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與模型組比較，卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），參竹心康湯小劑量組降低幅度低于卡托普利組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯高劑量組（P<0.01），見表1。

2.2心肌組織Smad2變化 模型組、卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組心肌Smad2均較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）；卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組心肌Smad2均明顯低于模型組（P<0.01），參竹心康湯小劑量組降低幅度低于卡托普利組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯高劑量組（P<0.05），見表2。

3 討論

慢性心力衰竭是心室充盈或射血功能受損的一組綜合征，其發(fā)生、發(fā)展與多種細(xì)胞因子參與的神經(jīng)內(nèi)分泌過度激活密切相關(guān)，而心肌纖維化是心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)[8]，同時(shí)心肌纖維化的進(jìn)展是促進(jìn)心衰發(fā)展的原因之一[9]，因此，有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，是防治慢性心力衰竭的重要途徑。心肌纖維化的概念是在20世紀(jì)90年代初確立的，它是指在心肌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中膠原含量過度增加或者膠原的組成部分發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降，影響心臟正常的收縮與舒張功能[10]。正常心臟是由心肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞周圍的心臟間質(zhì)構(gòu)成。心臟間質(zhì)主要包括細(xì)胞外基質(zhì)和脈管系統(tǒng)。ECM圍繞在心肌細(xì)胞周圍，其作用是保持心臟結(jié)構(gòu)的完整和功能的正常，它在心肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞的信息溝通中發(fā)揮著非常重要作用[11]。MF的主要成因便是心肌細(xì)胞外基質(zhì)中的心肌成纖維細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)活化、增殖及其導(dǎo)致的膠原增生和沉積，膠原中以羥脯氨酸的含量最多，故通常以羥脯氨酸作為心肌纖維化檢測(cè)指標(biāo)之一。

MF的發(fā)生是一個(gè)由多種體液因子共同作用的過程，在眾多調(diào)控因子中Smads蛋白發(fā)揮著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)有三大類Smads[12]： 第一類為特異型Smads，主要有Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，第二類為共同介質(zhì)型Smads，目前發(fā)現(xiàn)主要是Smad4，最后為抑制型Smads，如Smad6、Smad7。Smads通過參與轉(zhuǎn)化長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響心肌纖維化，而Brooks W等研究發(fā)現(xiàn)Smad2是傳導(dǎo)TGF-β的主要信息分子[13]。曲巍等研究發(fā)現(xiàn)心肌纖維化模型大鼠Smad2明顯表達(dá)，經(jīng)依普利酮干預(yù)后心肌纖維化明顯改善，Smad2表達(dá)也明顯降低，推測(cè)依普利酮可能通過抑制Smad2表達(dá)途徑抗心肌纖維化[14]。

以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為治療原則的參竹心康湯是喻正科主任醫(yī)師多年臨床實(shí)踐的結(jié)晶，以黨參、麥冬、黃芪、五味子、玉竹、丹參、三七等為主要組成，其前期研究已證明參竹心康湯能有效的治療慢性心力衰竭。本研究發(fā)現(xiàn)模型組、藥物治療組HYP高于假手術(shù)組，證明成功建立慢性心力衰竭心肌纖維化大鼠，卡托普利組和參竹心康湯組HYP水平低于模型組，證明卡托普利和參竹心康湯均有抗慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的作用，參竹心康湯治療組的Smad2水平明顯低于模型組，由此推測(cè)，參竹心康湯可有效的抑制慢性心力衰竭心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程，抑制Smad2的表達(dá)可能是其抗心肌纖維化的機(jī)制之一。

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