基于液相色譜

林敏 熊昕 余婷婷 張莉 劉迪

三唑酮是一種高效、低毒、持效期長(zhǎng)、內(nèi)吸性強(qiáng)的三唑類殺菌劑，但隨著農(nóng)藥的濫用，各種農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán)重，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)三唑酮?dú)埩粝蘖坑休^嚴(yán)格的規(guī)定，目前我國(guó)現(xiàn)有農(nóng)藥檢測(cè)方法缺點(diǎn)是操作繁瑣，同時(shí)準(zhǔn)確度不高，檢測(cè)過程時(shí)間長(zhǎng)，既繁瑣，又不安全。高效液相色譜法是一種較為先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，可以有效檢測(cè)食品安全問題。在食品檢測(cè)中，利用安全、高效的檢測(cè)方法，可以及時(shí)檢測(cè)出食品中的有害成分，保障食品安全，可以防止有害食品進(jìn)入市場(chǎng)，有效降低食品的安全風(fēng)險(xiǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)工作當(dāng)中。

試驗(yàn)材料

材料。（1）儀器與設(shè)備。超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Pipet-LiteXLS型移液器，RetschGM200型組織搗碎機(jī)，TGL-16M型高速離心機(jī)，N-EVAP型氮吹儀，Sep-PakVac型氨基固相萃取柱，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。（2）試劑和材料。三唑酮，乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，甲苯為優(yōu)級(jí)純，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；氯化鈉為優(yōu)級(jí)純，無(wú)水硫酸鈉為分析純，用前在650℃下灼燒4h，貯于干燥器中，冷卻后備用。

三唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取三唑酮標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，此溶液1mL相當(dāng)于1.00mg三唑酮。臨用時(shí)，用乙腈稀釋至所需的質(zhì)量濃度。

色譜條件。不同流動(dòng)相色譜條件見表1。色譜柱：WATERSACQUITYC18（50×2.1mm，1.7μm）型；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40℃。

質(zhì)譜條件。電離模式：ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔流速：50L/Hr；脫溶劑氣流速：900L/Hr；碰撞氣流速：0.17mL/min；母離子：294.2；子離子：197.1（定量離子），225.2；錐孔電壓：25V；碰撞能量：15，13eV。

試驗(yàn)方法。（1）樣品的提取。稱取樣品20 g于80 mL塑料離心管中，加入40 mL乙腈，用高速組織搗碎機(jī)在轉(zhuǎn)速15 000 r/min 下勻漿提取1 min，加入5 g NaCl，再勻漿提取1min，以4 000 r/min離心5min，取上清液20 mL （相當(dāng)于10 g 試樣量），在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至1 mL，待凈化。（2）提取液的凈化。在Sep-Pak Vac 型柱中加入約2 cm 高無(wú)水硫酸鈉，并放入下接雞心瓶的固定架上。加樣前先用4 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 預(yù)洗柱，當(dāng)液面到達(dá)硫酸鈉的頂部時(shí)，迅速將樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化柱上，并更換新雞心瓶接收。再每次用2 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 洗滌樣液瓶3 次，并將洗滌液移入柱中。在柱上加上50 mL 貯液器， 用25 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 洗脫農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品合并于雞心瓶中，并在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至凈干。將濃縮液置于氮?dú)獯蹈蓛x上吹干，迅速加入1 mL 的乙腈+ 水（3+2）混勻，經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾，供UPLC-MS/MS 分析。

線性關(guān)系。選擇不含有三唑酮的蘋果為果蔬樣品代表。準(zhǔn)確稱取20 g （精確至0.01 g） 未添加三唑酮的蘋果勻漿液，準(zhǔn)確加入三唑酮的對(duì)照品溶液，使樣品中三唑酮的質(zhì)量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0， 100.0 ng/mL， 分別對(duì)這些溶液進(jìn)行UPLCMS/MS 分析，記錄MRM 圖，得峰面積，并對(duì)各溶液的峰面積和質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

檢出限與定量限。檢出限與定量限是衡量方法靈敏度的指標(biāo)之一。將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋， 分別對(duì)這些溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，記錄MRM 圖中定量離子的信噪比，以3 倍信噪比計(jì)算得出檢出限，10 倍信噪比計(jì)算得出定量限。

回收率和精密度測(cè)定。選擇不含有三唑酮的西紅柿為果蔬樣品代表。按照加樣回收法低、中、高3 個(gè)水平對(duì)空白樣品進(jìn)行加標(biāo)，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3 份，使西紅柿樣品中三唑酮的添加量為0.125，0.250，0.500 μg/kg，按照1.4 方法進(jìn)行樣品處理。按照色譜- 質(zhì)譜方法進(jìn)樣，計(jì)算每個(gè)質(zhì)量濃度下的回收率，同時(shí)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)果與分析

線性關(guān)系。選用三唑酮的溶液質(zhì)量濃度為1.0-100.0 ng/mL的樣品溶液進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2 091.3X-778.58，R2=0.999 8。線性關(guān)系良好，完全符合方法學(xué)要求。

三唑酮的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖1，三唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 見圖2。

檢出限與定量限。對(duì)逐級(jí)稀釋溶液中三唑酮的質(zhì)量濃度進(jìn)行分析，將所得MRM 圖中的色譜峰進(jìn)行信噪比計(jì)算。質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL 時(shí)，信噪比大于3 倍空白信噪比，得出檢出限為0.5 ng/mL。質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL 時(shí)，信噪比大于10 倍空白信噪比，得出定量限為1.0 ng/mL。

回收率與精密度。蘋果樣品中三唑酮的回收率與精密度見表2

蘋果樣品中回收率為82.8%～94.7%。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)中對(duì)檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求中，被檢測(cè)組分濃度含量小于0.1 mg/kg 時(shí)，回收率達(dá)到60%～120%，即符合方法學(xué)的要求。計(jì)算各質(zhì)量濃度下平行3次的試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

實(shí)際樣品分析。依照以上的試驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)上出售的幾種蔬菜水果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，結(jié)果表明被檢測(cè)的幾種蔬菜水果中，均未檢出三唑酮。

討論

試驗(yàn)建立了一種快速檢測(cè)水果蔬菜中三唑酮農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測(cè)技術(shù)， 該方法回收率在84.9%～89.3%之間，完全符合方法學(xué)要求。該方法前處理簡(jiǎn)單，具有靈敏度高、分離效果好、重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于短時(shí)間內(nèi)大批量測(cè)定蔬菜水果中的三唑酮。

（作者單位：林敏 余婷婷 張莉 劉迪 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院；熊昕 湖北省食品藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評(píng)核查中心）