HE4在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義

任俊英 王維琴 王艷婷 皇甫昱

[摘要] 目的 通過檢測(cè)HE4在異位子宮內(nèi)膜、正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，以進(jìn)一步分析HE4在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展，以及良性疾病惡性表現(xiàn)中所起的作用。方法 選擇內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院2012年7月—2014年7月收治的90例，通過病理確診的子宮內(nèi)膜異位癥60例，正常內(nèi)膜組織的因子宮病變而進(jìn)行子宮全切術(shù)的患者30例。采用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法對(duì)兩組石蠟切片進(jìn)行化學(xué)染色，并進(jìn)行對(duì)染色結(jié)果的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)應(yīng)用mIgae-or-plus對(duì)染色切片中的陽性部分測(cè)量其平均灰度值（mean IOD），并分析HE4在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)情況。結(jié)果 ①HE4主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，而間質(zhì)中僅有少量表達(dá)，且腺體中的表達(dá)明顯高于間質(zhì)（P=0.000 <0.05）。異位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜組比較，腺上皮中的表達(dá)異位內(nèi)膜組高于正常內(nèi)膜組（χ2=7.200 0，P=0.007 <0.05）。②子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜在r-AFS分期中Ⅰ～Ⅱ期的HE4表達(dá)強(qiáng)度低于異位內(nèi)膜組Ⅲ～Ⅳ期，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.117，P=0.000 <0.05）。③異位內(nèi)膜組織在月經(jīng)周期的增生期HE4陽性表達(dá)高于分泌期HE4的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.496，P=0.000 <0.05）。正常內(nèi)膜組織在月經(jīng)周期的增生期HE4陽性表達(dá)高于分泌期HE4的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.483，P=0.000 <0.05）。結(jié)論 HE4在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜的表達(dá)增強(qiáng)，從r-AFS分期，I期至IV期，異位內(nèi)膜組織中含量呈上升趨勢(shì)，說明HE4可能參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和疾病的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] HE4；子宮內(nèi)膜異位癥；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2016）03（c）-0033-04

Expression of HE4 in the Endometriosis and Its Significance

REN Jun-ying1， WANG Wei-qin2， WANG Yan-ting1， HUANGFU Yu3

1. Department of Obstetrics and Gynecology， Hohhot First Hospital， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010030 China；2. Department of Obstetrics and Gynecology， Inner Mongolia Peoples Hospital， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010010 China；3. Department of Personnel， Hohhot Municipal Health Bureau， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010010 China

[Abstract] Objective To detect the expression of HE4 in endometriosis and normal endometrium， in order to further explore the generation and development of HE4 in endometriosis and its effect in benign disease with malignant manifestations. Methods In this study， the 90 tissue specimens are from the Department of Pathology， Inner Mongolia Peoples Hospital， from July 2012 to July 2014. Totally 60 endometriosis samples were investigated as the experimental group， and 30 normal endometrium tissue samples from 30 cases underwent hysterectomy due to uterine lesions were set as the negative control group. The expression of HE4 was examined by immunohistochemical staining between experimental group and control group. And the expression intensity of HE4 was estimated by the microscope. The mean IOD of positive expression rates of HE4 was determined by mIgae-or-plus. The expression of HE4 in the endometriosis was analyzed. Results ①HE4 mainly expressed in endometrial glandular epithelial cells， it only expressed a little in mesenchyme. The expression of HE4 in the glandular tissue was much more than that in the mesenchyme（P=0.000）. The expression of HE4 in the glandular epithelium in the ectopic group was higher than that in the normal endometrium group（χ2=7.200 0， P=0.007<0.05）. ② The expression of HE4 in ectopic endometrium r-AFS stage Ⅲ～Ⅳ was higher than that in stageⅠ～Ⅱin endometriosis（t=11.117， P=0.000）. ③ The expression of HE4 in proliferative phase of menstrual cycle was higher than that in secretory phase in the ectopic endometrium（t=10.496， P=0.000<0.05）. The expression of HE4 in proliferative phase of menstrual cycle was higher than that in secretory phase in the normal endometrinm（t=7.483， P=0.000<0.05）. Conclusion The expression of HE4 in ectopic endometrium in endometriosis is significantly higher than that in normal endometrium. With the stage increasing from r-AFS stage I to IV， the expression of HE4 shows a rising trend， which indicates that HE4 may participate in the occurrence and development of endometriosis.

[Key words] HE4； Endometriosis； Immunohistochemistry

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是婦女的常見病、多發(fā)病，好發(fā)于生育期婦女，該病的發(fā)病率近年來逐漸增加。臨床表現(xiàn)為下腹痛和痛經(jīng)、月經(jīng)異常、不孕等[1]。EMs是一種良性疾病，表現(xiàn)的細(xì)胞增生、侵潤(rùn)、復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為，以及有組織學(xué)惡變傾向，使之成為婦產(chǎn)科醫(yī)生的困擾。盡管先進(jìn)的研究日漸深入，但對(duì)其確切的發(fā)病機(jī)制仍然不明，治療上也就不滿意，成為婦產(chǎn)科臨床與基礎(chǔ)研究的焦點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。隨著國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)新發(fā)現(xiàn)的人附睪分泌蛋白因子4（human epididymis protein 4，HE4） 的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)HE4在子宮內(nèi)膜異位癥中也發(fā)揮著重要作用[3]。因此，該研究對(duì)2012年7月—2014年7月就診于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院的90例患者，根據(jù)術(shù)后病理確診為異位子宮內(nèi)膜60例、正常內(nèi)膜30例進(jìn)行免疫組化檢測(cè)HE4的表達(dá)結(jié)果，進(jìn)一步探討HE4與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象選擇內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院90例手術(shù)患者的石蠟標(biāo)本，通過病理確診其中子宮內(nèi)膜異位癥的石蠟標(biāo)本60例，患者年齡31～52歲，平均年齡35歲。對(duì)60例異位內(nèi)膜組織蠟塊進(jìn)行r-AFS分期中Ⅰ期8例、Ⅱ期18例、Ⅲ期24例、Ⅳ期10例。正常內(nèi)膜組織的因子宮病變而進(jìn)行子宮全切術(shù)的患者30例年齡41～56歲，平均年齡46歲。

實(shí)驗(yàn)組：異位內(nèi)膜組織蠟塊60例。對(duì)照組：正常內(nèi)膜組織30例。

1.2 試劑及方法

一抗：即用型兔抗人HE4多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，規(guī)格100 ug濃縮液。批號(hào)14406-1AP；保存開封后4 ℃保存。二抗：即用型SABC免疫組化染色試劑盒規(guī)格：12 mL 4℃保存，避免冷凍DAB試劑盒：以上試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司3%過氧化氫：購(gòu)于福州邁新生物公司自備試劑 購(gòu)于福州邁新生物公司：免疫組化專用PBS液（pH7.2～7.6）配法：1 000 mL蒸餾水中加氯化鈉8.5 g，Na2HPO4 2.8 g，NaH2PO4 0.4 g；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液：1 000 mL蒸餾水中加枸櫞酸三鈉（C6H5Na3O4·2H2O）3 g，枸櫞酸（C6H8O7·H2O）0.4 g；中性樹膠。

1.3 試驗(yàn)方法

免疫組化染色：標(biāo)本石蠟塊，制作成4 μm石蠟切片，烤片，脫蠟，水化，滴加3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）熱修復(fù)抗原，5%BSA封閉液滴加于每張切片，每張切片滴加第一抗體兔抗人多克隆抗體HE4，4 ℃冰箱過夜，PBS液洗片，每張切片加試劑山羊抗兔IgG，20～37 ℃溫箱下卵育20 min，PBS沖洗，每張切片滴加SABC，室溫下孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，封片，然后在顯微鏡下閱片并照相。

1.3.1 觀察標(biāo)準(zhǔn) 病理科由2名醫(yī)生用雙盲法分別進(jìn)行閱片監(jiān)測(cè)。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率分布按照SHIMIZU等方法確定HE4在組織中的表達(dá)水平。①染色強(qiáng)度，染色不清楚（和）或無染色為0分；染色強(qiáng)于陰性顯示為弱黃色為1分；染色清晰棕黃色為2分；染色強(qiáng)為深棕色（和）或褐色為3分。②陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分；11%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。每張切片計(jì)分等于以上兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)的乘積；0～1分為（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中度陽性（++）；﹥5分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3.2 平均灰度值測(cè)量 mIgae-or-plus5.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)下，測(cè)量每張切片的陽性細(xì)胞的平均灰度值（meanIOD）并將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

描述性資料以表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)；多個(gè)樣本均數(shù)比較，經(jīng)檢驗(yàn)方差不齊，采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)；異位子宮內(nèi)膜r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ與Ⅰ～Ⅱ期meanIOD值比較，因檢驗(yàn)方差不齊，采用兩獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。計(jì)數(shù)資料組間兩兩比較采用行×列資料分割的χ2檢驗(yàn)，經(jīng)校正α'=0.008；所得數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)測(cè)得的平均灰度值分析HE4在子宮異位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況

異位內(nèi)膜組織中HE4顆粒定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞膜及細(xì)胞漿中呈棕黃色陽性顆粒，部分間質(zhì)可見陽性表達(dá)，其表達(dá)的meanIOD值為0.580 1±0.011 5。正常內(nèi)膜組織中HE4顆粒定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞膜及細(xì)胞漿中呈淡黃色弱陽性顆粒，部分間質(zhì)可見弱陽性表達(dá)，其表達(dá)的meanIOD值為0.680 1±0.010 5。

2.2 HE4在子宮內(nèi)膜間質(zhì)與腺體中的表達(dá)比較

異位子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)不同強(qiáng)度HE4陽性表達(dá)的頻數(shù)分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.038，P=0.000﹤0.01）；而正常內(nèi)膜腺上皮及部分間質(zhì)也有淡黃色著色（+），腺體及間質(zhì)HE4陽性表達(dá)頻數(shù)分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.455，P=0.000﹤0.05）。見表1。

2.3 異位內(nèi)膜中不同臨床分期HE4的表達(dá)

異位內(nèi)膜組中Ⅰ～Ⅱ期HE4蛋白表達(dá)的meanIOD值為0.590 5±0.047；Ⅲ～Ⅳ期HE4蛋白表達(dá)的meanIOD值為0.571 9±0.008 2，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.117，P=0.000<0.05），見表2。

2.4 異位內(nèi)膜組織中HE4在增生期與分泌期的表達(dá)

在異位內(nèi)膜組增生期與分泌期中HE4表達(dá)的meanIOD值分別為0.571 3±0.008 1和0.589 6±0.005 2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.496，P=0.000<0.05）。見表3。

2.5 異位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜HE4在增生期與分泌期的表達(dá)

異位內(nèi)膜組中增生期與分泌期HE4表達(dá)的meanIOD值分別為0.571 3±0.008 1和0.589 6±0.005 2；正常內(nèi)膜組中增生期與分泌期患者子宮內(nèi)膜腺體中HE4表達(dá)的meanIOD值分別為0.670 5±0.006 9和0.687 6±0.005 7，各組增生期與分泌期meanIOD值兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.000<0.05）。見表4。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是婦女的多發(fā)病、常見病，好發(fā)于生育期婦女，該病的發(fā)病率近年來逐漸增加。其基本病理變化為異位內(nèi)膜組織病灶隨卵巢激素周期性變化發(fā)生出血，導(dǎo)致異位子宮內(nèi)膜纖維組織增生，盆腔粘連，異位囊腫的增大，甚至破裂，并表現(xiàn)出相應(yīng)的臨床癥狀引起患者不適、疼痛以及不孕，影響生活質(zhì)量[4]。

該研究通過對(duì)異位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜HE4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HE4在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于正常內(nèi)膜，且腺體中的表達(dá)高于間質(zhì)中表達(dá)；在子宮內(nèi)膜的增生期表達(dá)高于分泌期的表達(dá)；在異位內(nèi)膜r-AFS分期中高分期的表達(dá)要高于低分期的表達(dá)。推測(cè)HE4可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病，而且還可能與腺上皮高分泌有關(guān)。子宮內(nèi)膜異位癥患者HE4表達(dá)水平的上調(diào)隨子宮內(nèi)膜異位疾病r-AFS分期的進(jìn)展程度而升高，病情程度越嚴(yán)重，其HE4的表達(dá)越高，在r-AFS高分期的子宮內(nèi)膜異位癥中，由于HE4表達(dá)水平上調(diào)，使HE4發(fā)揮更強(qiáng)的作用及功能[4]，促使異位的子宮內(nèi)膜細(xì)胞更為廣泛地種植、侵襲及生長(zhǎng)，促進(jìn)EMs的發(fā)生發(fā)展。異位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜組中HE4的表達(dá)，增生期均高于分泌期，提示增生期的子宮內(nèi)膜的侵襲及遷移的能力高于分泌期。HE4可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病及疾病的異地粘附、侵襲、生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用[8]。近年來國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)輸卵管逆流入盆腔或經(jīng)侵入到子宮肌層的子宮內(nèi)膜碎片中，必須有活的子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞，方可能發(fā)生移位生長(zhǎng)、種植、并引起病變和相應(yīng)的癥狀[5-7]。

綜上所述，此次研究標(biāo)本來源于內(nèi)蒙古自治區(qū)近2年的生育期婦女子宮內(nèi)膜異位癥HE4的表達(dá)情況。還有待于進(jìn)一步的擴(kuò)大研究范圍，增加樣本量分析HE4在子宮內(nèi)膜異位癥具體的發(fā)病機(jī)制，提出更為有力的證據(jù)。 同時(shí)，在腫瘤靶向治療[9-10]快速發(fā)展的今天，也可能為子宮內(nèi)膜異位癥的靶向治療提供了一個(gè)新的思路。

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