毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定淮山中8種必需氨基酸含量

胡月芳，黃志強(qiáng)，李金芳

(賀州學(xué)院　化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西　賀州　542899)

毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定淮山中8種必需氨基酸含量

胡月芳*，黃志強(qiáng)，李金芳

(賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899)

摘要：將8種人體內(nèi)必需氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸)與鄰苯二甲醛(OPA)發(fā)生衍生化反應(yīng)，再采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)(CE-ED)方法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定?？疾炝搜苌瘯r(shí)間、檢測(cè)電位、運(yùn)行緩沖液濃度和pH值、分離電壓及進(jìn)樣時(shí)間等的影響。在優(yōu)化條件下，8種氨基酸在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分離，線(xiàn)性范圍為0.1～1 500 μg/L；檢出限為0.01～0.05 μg/L，峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～1.8%，遷移時(shí)間的RSD為0.6%～1.0%。該方法已用于淮山樣品中8種必需氨基酸的測(cè)定，加標(biāo)回收率為96.8%～102.0%，RSD均不大于2.4%。

關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳；電化學(xué)檢測(cè)；淮山；氨基酸

淮山別名山藥、懷山藥等，含有氨基酸(包括人體必需的8種氨基酸)、活性多糖、薯蕷皂苷、尿囊素、膽堿、黃酮、淀粉等成分，是一種常用藥材和較佳的保健食品[1]。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是化學(xué)、生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域的重要物質(zhì)[2-3]。隨著人們對(duì)淮山營(yíng)養(yǎng)成分認(rèn)識(shí)的加深，測(cè)定淮山中氨基酸的含量，尤其是8種人體必需的氨基酸含量成為評(píng)定淮山營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基本指標(biāo)之一。

近年來(lái)，一般采用傳統(tǒng)的液相色譜法或氨基酸分析儀分離氨基酸[4-6]，但色譜法在樣品分離前需對(duì)色譜柱進(jìn)行預(yù)處理或改性，色譜柱價(jià)格昂貴，分離效率不高，檢測(cè)速度慢，操作較繁瑣；氨基酸分析儀分析成本較高。毛細(xì)管電泳方法(CE)具有消耗樣品少、分離效率高，無(wú)需昂貴的色譜柱與復(fù)雜的前處理等優(yōu)點(diǎn)[7-10]；電化學(xué)檢測(cè)(ED) 對(duì)于電活性物質(zhì)具有較高的靈敏度和選擇性，采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)(CE-ED)測(cè)定氨基酸含量的研究已有報(bào)道[11-12]，但對(duì)淮山中8種人體必需的氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸)含量同時(shí)測(cè)定的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因大部分氨基酸無(wú)電化學(xué)活性、熒光發(fā)射及紫外吸收，通常使用衍生化方法使氨基酸在硫醇類(lèi)化合物存在下與鄰苯二甲醛(OPA) 發(fā)生反應(yīng)，生成具有電化學(xué)活性的強(qiáng)熒光衍生物之后，采用電化學(xué)、紫外、熒光、色譜法檢測(cè)[13-14]。本文先使所測(cè)氨基酸與OPA發(fā)生衍生反應(yīng)，再采用CE-ED法測(cè)定賀州市平桂區(qū)沙田鎮(zhèn)淮山中8種人體必需的氨基酸含量，為進(jìn)一步研究賀州市平桂區(qū)所產(chǎn)淮山的品質(zhì)，促進(jìn)淮山資源的開(kāi)發(fā)與利用提供了依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)(CE-ED，如圖1)為自組裝[11]，包括可調(diào)高壓電源(±30 kV)，CHI660D電化學(xué)工作站(北京華科普天科技有限公司)；石英毛細(xì)管長(zhǎng)55 cm，內(nèi)徑25 μm(河北永年光導(dǎo)纖維廠(chǎng))；三維定位調(diào)節(jié)器；三電極體系包括：工作電極(直徑125 μm銅圓盤(pán)電極)，對(duì)電極(鉑絲電極)，參比電極(Ag/AgCl電極)；0.22 μm的乙酸纖維素濾膜(上海新亞凈化器件廠(chǎng))。

圖1　自組裝 CE-ED 裝置示意圖

蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸、鄰苯二甲醛(OPA)、 硫醇試劑(Sigma公司)；淮山樣品購(gòu)于賀州市陽(yáng)光市場(chǎng)(產(chǎn)于賀州市平桂區(qū)沙田鎮(zhèn))，其他試劑均為分析純。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液與衍生試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度均為1.00 g/L，用二次蒸餾水配制，再用運(yùn)行緩沖液稀釋至所需濃度。

樣品溶液：取新鮮淮山于60 ℃烘干4 h，用研缽研成細(xì)粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g粉末，加入70%乙醇100 mL，在室溫下浸泡24 h。離心過(guò)濾，濾渣用70%乙醇10 mL洗滌 2 次，最后用0.10 mol/L的硼砂-H3BO3緩沖溶液定容至250 mL。

衍生化試劑：取50 mg OPA、1 mL(1 mol/L) 硫醇試劑、1 mL甲醇、1.8 mL(0.2 mol/L) Na2CO3和 NaHCO3混合溶液，超聲溶解，配制后立即進(jìn)行反應(yīng)。

1.3衍生化反應(yīng)原理

氨基酸與OPA衍生化反應(yīng)原理[15]：OPA與硫醇試劑聯(lián)用，堿性條件下(25 ℃)快速與一級(jí)氨基酸反應(yīng)，生成強(qiáng)熒光且具有電化學(xué)活性的衍生物1-硫代-2-烷基-異吲哚，可采用電化學(xué)、紫外、熒光等法檢測(cè)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

衍生化反應(yīng)：在25 ℃溫度下，取10 μL標(biāo)準(zhǔn)濃度氨基酸溶液，加入20 μL OPA 衍生化試劑，混勻30 s，靜置50 s后進(jìn)樣。為了保證衍生反應(yīng)的迅速和完全進(jìn)行，OPA衍生劑采用過(guò)量加入，其加入量約為理論氨基酸含量的2倍。

毛細(xì)管用0.1 mol/L的NaOH、二次蒸餾水、緩沖液分別沖洗10,5,15 min后使用；銅圓盤(pán)電極用細(xì)砂紙打磨，用粒徑0.3 μm的氧化鋁粉末拋光平整，并于0～0.95 V(vs.Ag/AgCl)之間在NaOH溶液中掃描，進(jìn)行電化學(xué)處理。采用自組裝的CE-ED檢測(cè)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)工作電極與毛細(xì)管出口在同一直線(xiàn)上，最大程度靠近毛細(xì)管的末端，以0.10 mol/L的硼砂-H3BO3溶液為運(yùn)行緩沖液，電動(dòng)進(jìn)樣，檢測(cè)池為陰極電泳槽。所有溶液使用前均用0.22 μm乙酸纖維素濾膜過(guò)濾。

2結(jié)果與討論

2.1衍生化反應(yīng)時(shí)間的選擇

由于氨基酸與OPA反應(yīng)生成衍生物的穩(wěn)定性不高，信號(hào)減弱快，故衍生化反應(yīng)時(shí)間必須嚴(yán)格控制。實(shí)驗(yàn)考察了衍生化時(shí)間在20～100 s之間時(shí)對(duì)8種氨基酸峰電流的影響。結(jié)果表明，衍生化時(shí)間過(guò)短，生成的衍生物的峰電流很低，信號(hào)很弱，檢測(cè)困難，檢出限不理想；而衍生化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，OPA試劑由透明變?yōu)槲ⅫS色，失去衍生功效，信號(hào)緩慢衰弱，也不能提高衍生物的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)衍生化時(shí)間為80 s時(shí)，衍生物的峰電流較穩(wěn)定，電流值與檢測(cè)靈敏度較高，故選擇80 s為最佳衍生化時(shí)間。

2.2檢測(cè)電位的選擇

考察了不同檢測(cè)電位對(duì)衍生化反應(yīng)80 s后8種氨基酸峰高的影響。結(jié)果顯示，在0.55～ 1.0 V 之間隨著檢測(cè)電位的增加，8種物質(zhì)的峰高不斷增高，且在0.85 V前增高較快，檢出限減低明顯；0.85 V之后峰高緩慢增高，檢出限變化不大。實(shí)驗(yàn)也表明，隨著檢測(cè)電位的增大，本底電流和噪音均增加，當(dāng)檢測(cè)電位高于0.85 V 時(shí)，基線(xiàn)很不穩(wěn)定，噪音較大，檢測(cè)靈敏度下降。綜合考慮靈敏度及穩(wěn)定性等因素，選擇0.85 V為最佳檢測(cè)電位。

圖2　緩沖溶液濃度對(duì)8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物遷移時(shí)間的影響Fig.2　Effect of buffer concentration on migration time of 0.5 mg/L eight standards

2.3運(yùn)行緩沖溶液濃度與pH值的選擇

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了硼砂-H3BO3電泳緩沖體系的基線(xiàn)較平穩(wěn)，檢測(cè)靈敏度較Tris-H3BO3高，故選擇硼砂-H3BO3作為運(yùn)行緩沖溶液?？疾炝瞬煌瑵舛鹊呐鹕?H3BO3溶液對(duì)分離效果的影響。如圖2所示，緩沖溶液濃度較低時(shí)，電泳電流低，8種氨基酸因遷移時(shí)間較短未能得到較好的基線(xiàn)分離；濃度太高時(shí)，分離時(shí)間隨遷移時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，使檢測(cè)變得耗時(shí)，且電泳電流增大導(dǎo)致基線(xiàn)噪音增大，從而降低檢測(cè)的靈敏度與峰高。綜合考慮，選擇0.10 mol/L的硼砂-H3BO3為最優(yōu)運(yùn)行緩沖溶液。

固定硼砂-H3BO3緩沖液濃度為0.10 mol/L，考察了其pH值在7.5～ 10.0范圍內(nèi)對(duì)分離檢測(cè)效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH值小于8.0時(shí)，8種氨基酸不能實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，隨著pH值的增加，8種氨基酸的遷移時(shí)間增長(zhǎng)，分離效果提高，但峰形變寬，噪音增大，檢測(cè)時(shí)間變長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度有所降低。綜合考慮8種氨基酸的分離效果、檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)靈敏度，選擇硼砂-H3BO3溶液的最佳pH值為8.0。

2.4分離電壓與進(jìn)樣時(shí)間的選擇

考察了分離電壓在13～ 23 kV范圍內(nèi)對(duì)分離檢測(cè)的影響。結(jié)果表明，分離電壓太低會(huì)使遷移時(shí)間變長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)間變長(zhǎng)，電泳峰形變寬，出現(xiàn)電泳峰重疊現(xiàn)象；隨著分離電壓的升高，則遷移時(shí)間逐漸縮短，可較快檢出分析物，但過(guò)高的分離電壓會(huì)使分離效果降低。因此，綜合考慮各物質(zhì)的分離度、靈敏度、檢測(cè)時(shí)間及焦耳熱等對(duì)分離檢測(cè)的影響，選擇17 kV為最優(yōu)分離電壓。

在選定最優(yōu)運(yùn)行緩沖溶液濃度、pH值和分離電壓條件下，考察了不同進(jìn)樣時(shí)間對(duì)峰高的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，峰高隨著進(jìn)樣時(shí)間的增長(zhǎng)而增高，檢出限降低。但進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)8 s后峰高增加不明顯，且電泳峰展寬，峰形拖尾，各分析物的分離效果降低，重現(xiàn)性差。綜合考慮，選擇8 s為最佳進(jìn)樣時(shí)間。

2.5重復(fù)性、線(xiàn)性范圍與檢出限

配制一系列不同濃度的8種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下進(jìn)行分離檢測(cè)，8種氨基酸的濃度分別在一定范圍內(nèi)與電泳峰電流呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表1所示。以0.5 mg/L 的8種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，電泳圖如圖3A所示。峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～1.8%，遷移時(shí)間的RSD為0.6%～1.0%，表明方法的重復(fù)性良好。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的優(yōu)勢(shì)，將本方法的檢測(cè)結(jié)果與其他方法進(jìn)行比較，相關(guān)數(shù)據(jù)表明，本方法的靈敏度較高，檢出限較低(見(jiàn)表2)。

ComponentLinearrange(μg/L)Regressionequation*(mg/L)rDetectionlimit(μg/L)Threonine0.1～1000y=4.578x+8.9670.99970.04Taline0.2～1200y=3.872x+5.0230.99960.05Methionine0.1～1300y=3.437x+2.7540.99980.03Isoleucine0.5～1500y=3.691x+2.8730.99970.01Leucine0.3～1200y=4.884x+9.8910.99950.01Phenylalanine0.4～1200y=3.975x+5.8170.99980.02Lysine0.1～1200y=3.878x+4.9870.99960.04Tryptophan0.2～1400y=3.789x+4.1870.99980.02

*x:analyte concentration;y:peak current

表2　本實(shí)驗(yàn)方法與其他方法檢測(cè)結(jié)果的比較

* not specified

2.6樣品測(cè)定與回收率

取淮山樣品超聲提取液100 μL，添加衍生化試劑OPA 20 μL，并進(jìn)行80 s衍生化反應(yīng)，加硼砂-H3BO3溶液定容至1.00 mL，搖勻,進(jìn)樣檢測(cè)淮山中8種必需氨基酸的含量，電泳圖如圖3B。與標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖相比，1，2，3，4，5，6，7，8，x峰分別為蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸和未知物的電流峰，表明8種必需氨基酸可在12 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，且分離效果良好。8種必需氨基酸的含量見(jiàn)表3，結(jié)果與文獻(xiàn)[16]相當(dāng)。

為再次驗(yàn)證CE-ED方法的可靠性，在淮山提取液中添加0.500 mg/g 8種必需氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，重復(fù)6次對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8種必需氨基酸的加標(biāo)回收率為96.8%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于2.4%，由此可見(jiàn)用CE-ED方法檢測(cè)淮山中氨基酸含量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可成為淮山中氨基酸分析的可行方法。

表3　淮山中8種氨基酸的含量及加標(biāo)回收率(n=6)

3結(jié)論

本文以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生劑與氨基酸發(fā)生衍生化反應(yīng)，采用CE-ED 法檢測(cè)淮山中8種必需氨基酸的含量。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，8種氨基酸在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，被測(cè)物濃度與峰電流呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。該方法簡(jiǎn)單可靠、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為淮山中氨基酸的測(cè)定提供了一種有效方法。淮山中8種氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果也表明，淮山具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有良好的開(kāi)發(fā)前景。

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Determination of Eight Essential Amino-acid in Yam by Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection

HU Yue-fang*,HUANG Zhi-qiang,LI Jin-fang

(College of Chemistry and Bioengineering，Hezhou University，Hezhou542899，China)

Abstract：After the derivatization reaction of 8 kinds of essential amino acids(threonine,valine,methionine,isoleucine,leucine,phenylalanine,lysine,tryptophan) in human body with o-phthalaldehyde(OPA),a method of capillary electrophoresis coupled with electrochemical detection(CE-ED) was established for the determination of these eight essential amino-acids.Effects of derivatization time,detection potential,concentration and pH value of running buffer,separation voltage and injection time on the detection were investigated.Under the optimum conditions,a good baseline separation and highly sensitive detection for eight essential amino-acid in yam were achieved in 12 min.The calibration curves of eight essential amino acids were linear in the range of 0.1-1 500 μg/L,with detection limits(S/N=3) of 0.01-0.05 μg/L.The relative standard deviations(RSDs) for peak heights of eight essential amino-acids were in the range of 1.3%-1.8%,and the RSDs for migration times were 0.6%-1.0%.The method was successfully applied in the assay of eight essential amino-acids in samples of yam,with spiked recoveries of 96.8%-102.0% and RSDs not more than 2.4%.

Key words：capillary electrophoresis;electrochemical detection;yam;amino-acid

收稿日期：2015-10-12；修回日期：2015-11-05

基金項(xiàng)目：廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究贊助項(xiàng)目(2013YB238)；賀州市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(賀科轉(zhuǎn)1408035)

*通訊作者：胡月芳，碩士，副教授，研究方向：電化學(xué)分析，Tel:0774-5271906，E-mail:huyuefang@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.017

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.8；O629.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1004-4957(2016)04-0471-05