多層面驗(yàn)證共培養(yǎng)微環(huán)境誘導(dǎo)法誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌樣分化

何林靜,　鄧伏雪,　胡云鳳,　朱衛(wèi)文,　伍家燕,　?！§o

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科, 重慶 400016)

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研究論文

多層面驗(yàn)證共培養(yǎng)微環(huán)境誘導(dǎo)法誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌樣分化

何林靜,鄧伏雪,胡云鳳,朱衛(wèi)文,伍家燕,常靜*

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科, 重慶 400016)

摘要:為了多層面探討共培養(yǎng)微環(huán)境誘導(dǎo)法定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)心肌樣分化的可行性,取第3代MSCs與原代心肌細(xì)胞(CMs)進(jìn)行共培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察誘導(dǎo)1周后的MSCs形態(tài)學(xué)變化,用免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分別檢測(cè)誘導(dǎo)的MSCs中心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)、Nkx-2.5和GATA-4的基因表達(dá)變化情況。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分別檢測(cè)誘導(dǎo)組和對(duì)照組的代謝產(chǎn)物。誘導(dǎo)1周后的MSCs形態(tài)呈心肌樣改變,cTnI、α-actin、Nkx-2.5和GATA-4的基因表達(dá)均明顯升高,正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)模型顯示誘導(dǎo)的MSCs代謝物向CMs轉(zhuǎn)變趨勢(shì)明顯。通過(guò)多元和單元統(tǒng)計(jì)分析篩選差異變量,根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜比對(duì)結(jié)果,最終確定12種差異代謝物。與未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs相比,經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs與CMs中變化趨勢(shì)相同的差異代謝物有7種,變化趨勢(shì)不同的差異代謝物有5種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,無(wú)論從形態(tài)、基因、蛋白質(zhì)還是代謝層面看,MSCs通過(guò)與CMs間接接觸共培養(yǎng)后均發(fā)生了心肌樣改變,但是與CMs仍存在差異。

關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)微環(huán)境;代謝組學(xué);心肌樣分化;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;心肌細(xì)胞

心血管疾病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康[1,2],心力衰竭是心血管疾病的終末階段表現(xiàn),其主要病理變化是心肌細(xì)胞(cardiomyocytes, CMs)數(shù)量減少。成熟CMs的再生能力有限,心肌組織中干細(xì)胞數(shù)量極少,而心臟移植又存在供體有限及排斥反應(yīng)等問(wèn)題,因此細(xì)胞移植成了一種有望治愈心力衰竭的新方法[3,4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)具備強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能[5],因此成為干細(xì)胞移植中比較理想的種子細(xì)胞[6]。誘導(dǎo)MSCs向心肌方向分化的方法包括化學(xué)物質(zhì)(如5-氮胞苷)誘導(dǎo)法及與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)法,其中前者存在轉(zhuǎn)化率低及致癌等問(wèn)題[7,8]。本實(shí)驗(yàn)在體外將MSCs與CMs進(jìn)行間接共培養(yǎng),一定程度上模擬了細(xì)胞移植到心肌組織后的體內(nèi)微環(huán)境,研究通過(guò)該方法誘導(dǎo)MSCs向心肌方向分化的可行性。

作為判定MSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的檢測(cè)方法,如免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)等已經(jīng)得到普遍應(yīng)用[9-11],并初步揭示了共培養(yǎng)微環(huán)境誘導(dǎo)MSCs心肌樣分化的機(jī)制。多種心肌細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)檢測(cè)是鑒定MSCs心肌樣分化的重要前提,然而僅靠鑒定個(gè)別細(xì)胞表面抗原表達(dá)手段單一,缺乏有效性和可靠性,并且誘導(dǎo)后的MSCs是否與CMs生物表型完全一致尚不能肯定。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后又一門(mén)新興的系統(tǒng)生物學(xué)科。近年來(lái),隨著代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,其臨床及科研應(yīng)用日益增多。與傳統(tǒng)研究技術(shù)相比,代謝組學(xué)技術(shù)具有敏感、快速以及不偏倚的特點(diǎn)。其檢測(cè)平臺(tái)主要有核磁共振(NMR)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)等[12]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)是一種新的代謝組學(xué)分析技術(shù),它對(duì)代謝表達(dá)差異性檢測(cè)更為敏感,穩(wěn)定性更好[13]。如果能找出相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物或代謝通路,可為MSCs心肌樣分化中的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠MSCs與新生乳鼠CMs間接共培養(yǎng)模擬心肌內(nèi)環(huán)境,研究心肌微環(huán)境對(duì)體外誘導(dǎo)MSCs定向分化的影響,分別從形態(tài)、基因、蛋白質(zhì)及代謝角度探索MSCs的微環(huán)境誘導(dǎo)法的可行性。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

4～6周成年SD(sprague dawley)大鼠1只,雌雄不限,體重200～250 g; 1～3天新生SD乳鼠8只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

DMEM/F12(dulbecco’s modified eagle medium/nutrient mixture F-12)培養(yǎng)基、胎牛血清、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑、成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液、茜素紅S、Alcian Blue(阿辛藍(lán))染色液、油紅O工作液(美國(guó)Gibco公司);磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司);膠原酶(美國(guó)Sigma公司);異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD(cluster of differentiation)11b、CD 29、CD 44和CD 45(美國(guó)Biolegend公司); FITC標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);心肌特異性肌鈣蛋白I(cTnI)抗體、α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)抗體(英國(guó)Abcam公司); transwell小室(美國(guó)Corning公司); RNAiso Plus試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix(日本Takara公司);乙腈(純度99.8%,美國(guó)TEDIA公司);甲酸(純度99.9%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司);甲醇(純度99.9%,中國(guó)成都科龍化工試劑廠);二氯甲烷(純度99.5%,中國(guó)重慶川東化工有限公司)。

倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);流式細(xì)胞儀(FCM,美國(guó)BD公司); CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);核酸濃度測(cè)定儀(美國(guó)Quawell公司);定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);LC-20 AD超高效液相色譜儀(日本島津公司);Triple TOF 5600質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司);KinetexXB-C18 色譜柱 (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm,美國(guó)菲羅門(mén)公司); OA-SYS氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)。

1.2MSCs的培養(yǎng)及鑒定

1.2.1MSCs的培養(yǎng)

采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs。用頸椎脫臼法處死4～6周成年SD大鼠,取雙側(cè)股骨、脛骨,去除軟組織,剪去長(zhǎng)骨兩頭,暴露骨髓腔,用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清按體積比9∶1混合)沖洗骨髓腔,將沖洗液中的細(xì)胞以2×106個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。2周后待細(xì)胞密度接近80%融合時(shí),以細(xì)胞數(shù)目1∶2的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2MSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)

取第3代MSCs,用2.5 g/L(0.25%(w/v))的胰酶充分消化,以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,用100 μL PBS重懸,計(jì)數(shù),使每管細(xì)胞數(shù)不小于1×106個(gè),加入帶熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD 11b、CD 29、CD 44和CD 45,置于冰盒中避光孵育40 min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析[14]。

1.2.3MSCs體外誘導(dǎo)分化能力鑒定

待24孔培養(yǎng)板內(nèi)第3代貼壁MSCs生長(zhǎng)至細(xì)胞密度約為70%時(shí),在試驗(yàn)孔中加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)25天,用10 g/L(1%(w/v))的茜素紅S染色。取1×106個(gè)細(xì)胞放入離心管,加入成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑,于離心管中培養(yǎng)21天。誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)固定后再染色,用10 g/L(1%(w/v))的Alcian Blue染色液染色。于試驗(yàn)孔中加入成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)21天,用油紅O工作液染色。于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3CMs的培養(yǎng)及鑒定

取1～3天新生SD乳鼠,手術(shù)摘取心臟,去除心底結(jié)締組織和心房,將心室剪成1 mm3組織碎塊。加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1 g/L(0.1%(w/v))的膠原酶于37 ℃消化5 min,反復(fù)消化4次。終止消化,用200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾,以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,棄上清液,重懸接種于6孔板中,于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。60 min后,通過(guò)差速貼壁法分離成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新6孔板培養(yǎng),培養(yǎng)7天后用于免疫熒光鑒定。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

建立共培養(yǎng)體系,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組為單獨(dú)培養(yǎng)的原代CMs,陰性對(duì)照組為單獨(dú)培養(yǎng)的第3代MSCs。共培養(yǎng)誘導(dǎo)組:取第3代MSCs接種于6孔板中,次日在transwell小室內(nèi)加入5倍細(xì)胞數(shù)目的CMs,將小室插入6孔板內(nèi)。48 h后換液,觀察1周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.5鑒定MSCs心肌樣分化

1.5.1免疫熒光

取誘導(dǎo)組和陰性對(duì)照組的MSCs,去除細(xì)胞培養(yǎng)基,用甲醇于-20 ℃固定10 min。于室溫加入50 μL正常非免疫山羊血清(用PBS按體積比1∶10稀釋)封閉30 min。吸除封閉血清并加入50 μL一抗(用PBS按體積比1∶50稀釋的抗cTnI抗體),于4 ℃濕盒中孵育過(guò)夜。次日室溫放置1 h,用PBS清洗,加入50 μL二抗(用PBS按體積比1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG),室溫孵育2 h。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室溫染色5 min,加抗熒光淬滅封片劑,熒光顯微鏡下觀察。

按上述方法進(jìn)行α-actin免疫熒光染色并觀察。

1.5.2RT-PCR

采用RNAiso Plus試劑提取誘導(dǎo)組和對(duì)照組的細(xì)胞總RNA,測(cè)定光密度值(OD),計(jì)算總RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再經(jīng)定量PCR儀擴(kuò)增。

PCR引物如下。Nkx-2.5: (F)5′-CAGTGGAGCTGGACAAAGCC-3′,(R)5′-TAGCGACGGTTCTGGAACCA-3′; GATA-4: (F)5′-CTGTCATCTCACTATGGGCA-3′,(R)5′-CCAAGTCCGAGCAGGAATTT-3′; Actin: (F)5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′,(R)5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′。

PCR反應(yīng)體系為:2.5 μL 10×buffer(緩沖液), 2.0 μL 25 mmol/L Mg2+, 0.5 μL 10 mmol/L dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸), 1.0 μL上游引物,1.0 μL下游引物,2.0 μL cDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸), 0.5 μL 5 U/μL的Taq酶,15.5 μL去離子水。

反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性4 min, 94 ℃變性40 s, 60～62 ℃退火40 s, 72 ℃延伸60 s。經(jīng)分析系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)的定量檢測(cè)。

1.5.3UPLC-MS/MS

樣品預(yù)處理[15]:用細(xì)胞計(jì)數(shù)法收集等量誘導(dǎo)組和對(duì)照組細(xì)胞,用PBS重懸,超聲破碎。加入400 μL乙醇-乙酸乙酯(1∶1, v/v),以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清液,加入200 μL甲醇,混勻,以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清液。加入200 μL甲醇-水(3∶1, v/v),混勻,以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清液。加入200 μL二氯甲烷-甲醇(3∶1, v/v),混勻。全程在冰上操作。每組吸出1 mL上清液,置于氮吹儀中常溫吹干,用100 μL的甲醇-水(4∶1, v/v)復(fù)溶,振蕩2 min,超聲10 min,以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,吸出60 μL的溶液用于進(jìn)樣。

樣品分析[15]:每組吸取1 μL進(jìn)樣,用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析,每組重復(fù)6次。陽(yáng)離子模式和陰離子模式中均使用Turbo V ESI離子源,從Triple TOF MS流出的樣品以流速為0.35 mL/min的速度注入Kinetex XB-C18柱。毛細(xì)管電壓:5.5 kV;霧化氣體壓力:1 379 Pa;渦旋氣體壓力:250.7 Pa;電離電壓:5 500 V(ESI+)或-5 500 V(ESI-);離子源溫度:500 ℃;碰撞能量:10 V(ESI+)或-10 V(ESI-);去簇電壓:80 V(ESI+)或-80 V(ESI-)。流動(dòng)相A:水;流動(dòng)相B:乙腈。流動(dòng)相梯度:0～1.0 min, 1%B; 1.0～12.0 min, 1%～85%B; 12.0～12.1 min, 85%～5%B; 12.1～15.0 min, 5%B。霧化氣體和渦旋氣體的壓力均為379.225 kPa,加熱溫度為600 ℃。在增強(qiáng)全掃描模式中使用電噴霧電離進(jìn)行全掃描分析。掃描范圍為m/z50～1 000,掃描速率為1 000次/min。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理使用機(jī)器自帶軟件MarkerView 1.2.1對(duì)所提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)、峰對(duì)齊、pareto(帕累托)縮放以及標(biāo)準(zhǔn)化。其中對(duì)缺失值使用80%去值原則,去除缺失值過(guò)多的變量,將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0對(duì)其進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。將OPLS-DA分析中變量權(quán)重性投影(VIP)值大于1的變量導(dǎo)出,用SPSS 17.0進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn),將P<0.05的變量保留下來(lái)。再將得到的變量導(dǎo)入Shortcut to Peak View,導(dǎo)出二級(jí)質(zhì)譜并在Massbank、HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)二級(jí)質(zhì)譜,找到可能的對(duì)應(yīng)物質(zhì)。

2結(jié)果與討論

2.1MSCs的培養(yǎng)及鑒定

2.1.1MSCs的形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)志物鑒定

MSCs接種后為單個(gè)細(xì)胞,呈圓形,未伸展。24 h后瓶底出現(xiàn)貼壁細(xì)胞,呈長(zhǎng)梭形,成纖維細(xì)胞樣,散布于瓶底,換液去除造血細(xì)胞。4～5天后,細(xì)胞開(kāi)始迅速增殖,體積變大,形成多個(gè)細(xì)胞集落,呈旋渦狀、火山口狀或放射狀排列。2周后細(xì)胞集落逐漸增大,相互融合連接,待密度達(dá)到80%時(shí)即可傳代。傳代培養(yǎng)的MSCs表達(dá)CD 29和CD 44,陽(yáng)性率分別為99.88%和99.99%,而CD 11b和CD 45表達(dá)呈陰性。

2.1.2體外誘導(dǎo)的MSCs具有多項(xiàng)分化能力

如圖1所示,MSCs經(jīng)成骨方向誘導(dǎo)25天后,用茜素紅S染色可見(jiàn)紅色礦化結(jié)節(jié);經(jīng)成軟骨方向誘導(dǎo)21天后,用Alcian Blue染色,可見(jiàn)蛋白多糖呈藍(lán)色;經(jīng)成脂方向誘導(dǎo)21天后,用油紅O染色,可見(jiàn)胞質(zhì)中橙紅色圓形或類(lèi)圓形脂肪滴。

圖 1　　　體外誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的多項(xiàng)分化能力(100×)Fig. 1　　　Multilineage differentiation of induced bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro (100×)　a. osteogenic differentiation; b. chondrogenic differentiation; c. adipogenic differentiation.

2.2CMs的培養(yǎng)及鑒定

采用60 min差速貼壁法[16]可得到純度為95%的CMs。貼壁4～6 h后,細(xì)胞伸出偽足變成菱形或多角形。20 h后,可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞的搏動(dòng),頻率不等(40～120次/min); 3～4天后,細(xì)胞伸出的原生質(zhì)突起互相接觸交織呈網(wǎng)狀,形成同步性搏動(dòng)的細(xì)胞單層,頻率為80次/min左右,持續(xù)約30天后逐漸消失。免疫熒光結(jié)果顯示95%以上的細(xì)胞為cTnI及α-actin陽(yáng)性(見(jiàn)圖2)。

2.3共培養(yǎng)的MSCs形態(tài)學(xué)觀察與免疫熒光檢測(cè)

MSCs與CMs體外間接共培養(yǎng)1周后,MSCs胞體變大,伸出偽足,呈扁平多角形并相互連接,連接細(xì)胞出現(xiàn)肌管樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)免疫熒光檢測(cè)(見(jiàn)圖3),可見(jiàn)誘導(dǎo)組的MSCs胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色(cTnI)和紅色(α-actin)熒光,cTnI及α-actin表達(dá)呈陽(yáng)性,胞核呈藍(lán)色。而單獨(dú)培養(yǎng)的陰性對(duì)照組MSCs呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞增殖較快,大量子代細(xì)胞形成,免疫熒光檢測(cè)未見(jiàn)cTnI及α-actin的表達(dá)。

圖 2　　　心肌細(xì)胞(CMs)的免疫熒光圖(100×)Fig. 2　　　Immunofluorescence images of cardiomyocytes (CMs) (100×)　a. expression of cTnI (green) in CMs; b. expression of α-actin (red) in CMs. Blue: nucleus stained by DAPI.

圖 3　　　MSCs與CMs共培養(yǎng)前后心肌特異性標(biāo)記物的免疫熒光圖(100×)Fig. 3　　　Immunofluorescence images of muscle-specific markers in MSCs co-cultured with or without CMs (100×)　a. positive immunofluorescence against cTnI (green) in MSCs co-cultured with CMs; b. positive immunofluorescence against α-actin (red) in MSCs co-cultured with CMs; c. negative immunofluorescence against cTnI in MSCs cultured without CMs; d. negative immunofluorescence against α-actin in MSCs cultured without CMs. Blue: the nucleus stained by DAPI.

近幾年的研究[17]表明,利用transwell小室建立間接共培養(yǎng)體外微環(huán)境可誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化。α-actin主要存在于肌細(xì)胞胞質(zhì)中,是骨骼肌與心肌特異性表達(dá)的具有收縮功能的細(xì)胞骨架蛋白,為胎兒或新生兒心室肌的主要成分,α-actin陽(yáng)性說(shuō)明MSCs發(fā)生了肌源性分化[9]。cTnI是心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白,在參與調(diào)控肌纖維的舒縮活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,cTnI陽(yáng)性表明誘導(dǎo)后的MSCs有心肌細(xì)胞特征[9]。

2.4RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

以Actin為內(nèi)參,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,當(dāng)P<0.05時(shí)，基因表達(dá)差異顯著。如圖4所示,陽(yáng)性對(duì)照組CMs中Nkx-2.5和GATA-4的mRNA呈高表達(dá);陰性對(duì)照組MSCs中Nkx-2.5和GATA-4的mRNA呈低表達(dá);共培養(yǎng)誘導(dǎo)1周后,誘導(dǎo)組MSCs中Nkx-2.5和GATA-4的mRNA表達(dá)增強(qiáng)。

圖 4　　　RT-PCR檢測(cè)經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs中轉(zhuǎn)錄因子Nkx-2.5　　　和GATA-4的基因表達(dá)情況Fig. 4　　　Gene expressions of the transcription factors　　　(Nkx-2.5 and GATA-4) in induced MSCs by RT-PCR　* P<0.05, ** P<0.01.

Nkx-2.5與GATA-4是目前研究較多的與心臟發(fā)育密切相關(guān)的早期轉(zhuǎn)錄因子[10,11]。Nkx-2.5在心肌開(kāi)始分化前即開(kāi)始表達(dá),持續(xù)表達(dá)于心肌細(xì)胞分化階段,隨后在胚胎、胎兒和成體心肌細(xì)胞中保持一定的表達(dá)水平。GATA-4是調(diào)節(jié)心臟基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,參與了心臟正常發(fā)育、功能基因表達(dá)和心肌肥大的病理過(guò)程,是心臟前體細(xì)胞最早的標(biāo)志物之一。Nkx-2.5與GATA-4的表達(dá)表明MSCs經(jīng)共培養(yǎng)微環(huán)境誘導(dǎo)后向心臟前體細(xì)胞進(jìn)行分化。

2.5基于UPLC-MS/MS的細(xì)胞代謝組學(xué)分析

相比于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué),代謝組學(xué)具有下列優(yōu)勢(shì):1.由于基因或蛋白質(zhì)的微小變化將會(huì)在代謝產(chǎn)物上得到放大,所以利用代謝組學(xué)使得結(jié)果更容易檢測(cè);2.由于代謝產(chǎn)物的種類(lèi)相比基因和蛋白質(zhì)的數(shù)目要小很多,所以其檢測(cè)種類(lèi)少;3.由于代謝物在各種生物機(jī)體內(nèi)都是類(lèi)似的,所以代謝產(chǎn)物具有通用性的特點(diǎn)。UPLC-MS/MS是一種新的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù),具有分辨率高、敏感性高、快捷、方便等優(yōu)點(diǎn)[18,19]。因此,本文用UPLC-MS/MS對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞的代謝物進(jìn)行檢測(cè),采用多元和單元統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析,以期找到CMs及MSCs在誘導(dǎo)前后代謝產(chǎn)物的不同,篩選出差異代謝產(chǎn)物和與之相關(guān)的差異代謝通路。

圖 5　　　經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs代謝物的OPLS-DA得分圖Fig. 5　　　OPLS-DA score plot of the metabolites 　　　of the induced MSCs

利用OPLS-DA方法去除與樣品分類(lèi)無(wú)關(guān)的信息,對(duì)誘導(dǎo)組及對(duì)照組細(xì)胞代謝全譜進(jìn)行分析。圖5是UPLC-MS/MS檢查的細(xì)胞代謝物全譜數(shù)據(jù)的OPLS-DA分類(lèi)圖,該模型包含3個(gè)主成分:1為陰性對(duì)照組的MSCs, 2為陽(yáng)性對(duì)照組的CMs, 3為誘導(dǎo)組的MSCs。模型參數(shù)R2X=0.72及Q2=0.56說(shuō)明模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力較強(qiáng),其中X代表在橫坐標(biāo)的解釋能力(單位為cum),R2代表模型中相應(yīng)主成分對(duì)整體變異的解釋能力,Q2表示主成分對(duì)模型變異的預(yù)測(cè)能力。一般來(lái)說(shuō),R2X和Q2均大于0.5才能說(shuō)明模型構(gòu)建成功。圖5顯示對(duì)照組與誘導(dǎo)組樣本能明顯區(qū)分,經(jīng)誘導(dǎo)分化1周后的第3組樣本向第2組樣本靠近而遠(yuǎn)離第1組樣本,說(shuō)明誘導(dǎo)的MSCs代謝變化有逐漸向陽(yáng)性對(duì)照組的CMs轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。這從代謝角度表明了共培養(yǎng)誘導(dǎo)后MSCs的代謝向心肌細(xì)胞的代謝改變。

VIP值是OPLS-DA模型有監(jiān)督性分析方法中評(píng)價(jià)變量貢獻(xiàn)的最常用方法。本文設(shè)定VIP>1和P<0.05(差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),在HMDB和MassBank數(shù)據(jù)庫(kù)中分別比對(duì)一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜,最終推定其變量可能對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。與陰性對(duì)照組的MSCs相比,誘導(dǎo)組的MSCs和陽(yáng)性對(duì)照組CMs的差異代謝物中變化趨勢(shì)相同的物質(zhì)有L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、PC(18∶1(9Z)/14∶0)(聚碳酸酯)、LysoPE(22∶6 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0)(溶血性聚乙烯)、deterrol stearate(硬酸酯)、pyrrolidonecarboxylic acid(吡咯烷酮羧酸)、AS 1-2(鞘糖脂);誘導(dǎo)組的MSCs和陽(yáng)性對(duì)照組CMs的差異代謝物中變化趨勢(shì)不同的物質(zhì)有甘氨酸芐酯、DHAP(18∶0) (磷酸二羥丙酮)、LysoPC(16∶0)(溶血性磷脂酰膽堿)、LysoPC(20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z))、尿苷(見(jiàn)表1)。

心臟為高耗能器官,為保證其能夠持續(xù)進(jìn)行有節(jié)律的搏動(dòng),需要源源不斷的能量供給。谷氨酰胺是代謝旺盛細(xì)胞重要的能源物質(zhì),對(duì)維持細(xì)胞正常的能量代謝具有重要意義。心肌細(xì)胞中存在大量的谷氨酰胺酶,在其催化下谷氨酰胺通過(guò)脫氨基反應(yīng)生成谷氨酸,后者在谷氨酸脫氫酶的作用下氧化脫羧,生成α-酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化供能。近年來(lái)的研究[20,21]表明,在缺血再灌注損傷后,谷氨酰胺能促進(jìn)心肌組織糖原重新合成,調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)碳水化合物代謝,促進(jìn)ATP合成,增加細(xì)胞生物能量?jī)?chǔ)備,同時(shí)促進(jìn)谷胱甘肽和金屬硫蛋白合成,減少自由基生成,減輕心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損害,維護(hù)細(xì)胞正常的能量代謝。也有研究證明谷氨酰胺可通過(guò)己糖胺合成途徑避免心臟缺血再灌注損傷,并且對(duì)冠心病病人的心臟有保護(hù)作用[22]。因此,經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs中升高的谷氨酰胺提示MSCs已發(fā)生心肌樣分化。

生理?xiàng)l件下,不同于其他器官(如肝臟和腦)可利用循環(huán)中的多種物質(zhì)作為其能量來(lái)源(如葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、酮體等),心臟心肌細(xì)胞60%～70%的ATP由脂肪酸的β-氧化提供,以維持心臟生理性收縮活動(dòng)所需的大量能量[23]。篩選出的差異代謝物中有相當(dāng)一部分為脂類(lèi),尤其是磷脂類(lèi)物質(zhì),如LysoPC(16∶0)、LysoPC(20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(18∶1(9Z)/14∶0)、LysoPE(22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0)、deterrol stearate等。作為磷脂類(lèi)物質(zhì)重要分支的甘油磷脂類(lèi)物質(zhì)除構(gòu)成生物膜外,還是膽汁和膜表面活性物質(zhì)等的成分之一,參與細(xì)胞膜對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)。在本研究中發(fā)現(xiàn)多種LysoPC在CMs和經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs中的含量與誘導(dǎo)前的MSCs相比呈上調(diào)趨勢(shì),這可能與磷脂酸類(lèi)物質(zhì)引起外鈣內(nèi)流的鈣離子動(dòng)員效應(yīng)、參與心肌細(xì)胞膜的構(gòu)成有關(guān),同時(shí)也是心肌收縮力的標(biāo)志[24,25]。

表 1　　　CMs、經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs和MSCs相比的差異代謝物

↑: up-regulated; ↓: down-regulated.

3結(jié)論

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外間接共培養(yǎng),一定程度上模擬了體內(nèi)心肌內(nèi)環(huán)境,從細(xì)胞的形態(tài)變化、免疫熒光、基因表達(dá)及代謝組學(xué)層面證實(shí)共培養(yǎng)微環(huán)境能夠在體外誘導(dǎo)MSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞,且分化的細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的特性,但是其代謝表型仍存在一定差異。這為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本研究未進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞電生理及起搏基因等檢測(cè),故未能了解其具體功能變化,如膜電位變化和If(Na+內(nèi)流)電流等,有待于進(jìn)一步深入研究。

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Feasibility of cardiac differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by co-culture indirectly with cardiomyocytes in several dimensions

HE Linjing, DENG Fuxue, HU Yunfeng, ZHU Weiwen, WU Jiayan, CHANG Jing*

(Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Abstract:The objective of this research is to investigate the feasibility of cardiac differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) by co-culture with cardiomyocytes (CMs) in vitro. The third generation of MSCs from bone marrow and CMs were co-cultured indirectly in a transwell. One week later, the expressions of muscle-specific markers (cardiac troponin I and α-actin) by immunofluorescence staining and the gene expressions of transcription factors (Nkx-2.5 and GATA-4) were measured by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Then, orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) models were employed to confirm the difference among MSCs, induced MSCs and CMs by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) analysis. The distinctive changes were identified by multivariate analysis and variate analysis, and the changed metabolites were identified by MS and MS/MS. One week after co-cultured with CMs indirectly, the specific myocardium morphology of MSCs was observed under microscope. The positive immunofluorescence stainings against cTnI and α-actin were detected, and the positive expressions of the transcription factors Nkx-2.5 and GATA-4 were measured by RT-PCR. In OPLS-DA mode, obvious trend of cardiac differentiation of MSCs can be seen, and seven metabolites were tested both in induced MSCs and CMs, but five metabolites were tested in induced MSCs or CMs. Cardiac differentiation of MSCs can be induced by co-cultured with CMs indirectly in vitro. However, metabolism difference still existed between induced MSCs and CMs.

Key words:co-culture microenvironment; metabonomics; myocardium-like differentiation; bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs); cardiomyocytes (CMs)

中圖分類(lèi)號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)04-0414-08

基金項(xiàng)目:國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目(2011170).

*收稿日期:2016-01-06

DOI:10.3724/SP.J.1123.2016.01006

*通訊聯(lián)系人.Tel:(023)89011590,E-mail:chang8753@163.com.

Foundation item: National Key Clinical Specialties Construction Program of China (No. 2011170).