在線柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測法同時測定牛肉中16種磺胺類藥物殘留

許　旭,　肖遠燦,　耿丹丹,　皮　立,　董　琦,　胡風祖

(1. 中國科學院西北高原生物研究所, 青海 西寧 810008; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

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研究論文

在線柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測法同時測定牛肉中16種磺胺類藥物殘留

許旭1,2,肖遠燦1*,耿丹丹1,2,皮立1,董琦1,胡風祖1*

(1. 中國科學院西北高原生物研究所, 青海 西寧 810008; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

摘要:在考察了熒光胺、鄰苯二甲醛、異硫氰酸熒光素和2,3-萘二醛等對磺胺類藥物衍生效果的基礎上,建立了采用改良QuEChERS方法進行樣品前處理,熒光胺在線柱后衍生,高效液相色譜-熒光檢測法測定牛肉中16種磺胺殘留量的方法。牛肉樣品經1%(v/v)乙酸乙腈溶液提取,改良QuEChERS方法凈化后取上清液進樣,與熒光胺柱后在線衍生,熒光檢測器檢測。實驗結果表明,16種磺胺類藥物在0.024～2.533 mg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(r)大于0.992,檢出限為1.6～8.2 μg/kg,平均加標回收率范圍為66.6%～109.5%,相對標準偏差為0.9%～9.9%。該方法快速簡便、靈敏度高、凈化效果好,可用于牛肉中16種磺胺類藥物的快速測定。

關鍵詞:QuEChERS;熒光胺;在線柱后衍生;高效液相色譜-熒光檢測法;磺胺類藥物;牛肉

磺胺類藥物(sulfonamides, SAs)是一類人工合成的抗菌藥[1,2],能夠抑制細菌的生長繁殖,具有較強的抗菌作用[3,4]?；前奉愃幬飪r效高、抗菌譜廣、毒性小且使用方便,廣泛應用于畜牧生產[5,6]。但磺胺類藥物的不合理使用會通過肉類食品在人體內蓄積,給人體造成各種潛在危害[7-9]。因此,各國對食品中磺胺類藥物的最高殘留量均有明確規(guī)定[10-12],大多數(shù)國家規(guī)定動物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留量為100 μg/kg[13,14]。

目前,磺胺類藥物的檢測方法應用最多的是高效液相色譜-紫外檢測法和高效液相色譜-質譜法[15-17]。但由于采用紫外檢測器時靈敏度低,選擇性差,高效液相色譜-紫外檢測法有一定局限性,而高效液相色譜-質譜法所用儀器昂貴,且對檢測要求高,普及具有較大難度。高效液相色譜-熒光檢測法不僅靈敏度和特異性高且檢測成本低,適用于磺胺類藥物的多殘留檢測。

磺胺類藥物的熒光檢測通常需要采用衍生試劑將磺胺藥物衍生后才能用熒光檢測器檢測。據(jù)國內外文獻報道,能與磺胺類藥物作用的衍生試劑主要有熒光胺[18-21]和鄰苯二甲醛[22],其他能與磺胺類藥物發(fā)生熒光衍生反應的衍生試劑還未見報道。磺胺類藥物具有的4-氨基-苯磺酰胺基團上較活潑的氨基與氨基酸中具有的伯氨基團的結構相似,是否可以采用對氨基酸伯氨基具有熒光衍生的試劑來進行磺胺類藥物的熒光衍生,這樣的研究未見報道。

本文考察了熒光胺、鄰苯二甲醛、異硫氰酸熒光素和2,3-萘二醛等對磺胺類藥物的熒光衍生效果,并采用QuEChERS前處理方法結合柱后在線衍生技術,建立了高效、靈敏、快速的牛肉中磺胺類藥物殘留量的高效液相色譜-熒光檢測方法。

1實驗部分

1.1實驗設備與試劑

1525高效液相色譜儀(美國Waters公司),配2475熒光檢測器;PCR2-R050-R015柱后衍生系統(tǒng)(美國SSI公司); IKA T25高速勻漿機和RV-10旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA公司); TDL-40B離心機(上海安亭科學儀器廠); XK80-A快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司); AG135型精密電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);優(yōu)普UPE-II-40L型超純水機(成都優(yōu)普超純科技有限公司)。

磺胺類藥物標準品:磺胺醋酰(sulfacetamide, SCM)、磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)、磺胺噻唑(sulfathiazole, STZ)、磺胺吡啶(sulfapyridine, SPD)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SM1)、磺胺對甲氧嘧啶(sulfameter, SMT)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine, SM2)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine, SMP)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶鈉(sulfamonomethoxine sodium hydrate, SMM)、磺胺二甲異惡唑(sulfisoxazole, SSX)、苯?；前?sulfabenzamide, SBZ)、磺胺苯吡唑(sulfaphenazole, SPP)、磺胺氯吡嗪鈉(sulfaclozine sodium monohydrate, SPZ)、磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)、磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline, SQZ)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度均不低于98%;熒光胺、鄰苯二甲醛(OPA純度均大于99%(美國Sigma公司);異硫氰酸熒光素(純度≥95%)和2,3-萘二醛(純度≥99%)(上海安譜實驗科技股份有限公司);十八烷基鍵合硅膠(C18,粒徑40～63 μm)、丙基乙二胺吸附劑(PSA,粒徑40～63 μm)、石墨化炭黑(GCB,粒度120～400 目) 及無水MgSO4、NaAc(生化級)(上海安譜實驗科技股份有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純試劑,其他均為分析純。

標準儲備溶液:分別稱取一定量的磺胺類藥物標準品于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成700～750 mg/L的標準儲備溶液,于4 ℃下保存。

混合標準儲備液:分別取16種磺胺藥物標準儲備溶液各0.5 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,于4 ℃下保存。

根據(jù)文獻及衍生試劑性質配制衍生溶液。0. 2 g/L熒光胺溶液[18,19]:稱取0.04 g熒光胺,加入100 mL乙腈溶解,再加入20 mL甲醇和80 mL乙酸溶液混勻,保存在棕色瓶中,現(xiàn)用現(xiàn)配;鄰苯二甲醛溶液[22,23]:取1 mL冰乙酸、1 mL磷酸和3 g硼酸,用500 mL超純水溶解,再用NaOH溶液調pH至2.4;稱取鄰苯二甲醛0.4 g，用2.5 mL甲醇溶解后加入到上述溶液中混合,現(xiàn)用現(xiàn)配;異硫氰酸熒光素溶液[19,20]:稱取0.04 g異硫氰酸熒光素,加入40 mL乙酸和60 mL水溶解,再加入150 mL乙醇混勻,現(xiàn)用現(xiàn)配;2,3-萘二醛溶液[20,21]:稱取0.04 g 2,3-萘二醛,加入100 mL乙腈溶解,再加入20 mL甲醇、40 mL乙酸和40 mL乙腈混勻,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2樣品前處理

稱取勻質的牛肉試樣5.00 g置于預先加入4. 00 g無水MgSO4、1.5 g NaAc的50 mL聚丙烯離心管中,準確加入10 mL 1%(v/v)乙酸乙腈溶液,高速勻漿2 min,于4 000 r/min下離心5 min,取上清液待凈化。

將上清液置于預先加入750 mg無水MgSO4、160 mg PSA、100 mg GCB和25 mg C18吸附劑的15 mL離心管中，劇烈渦旋混合1 min,于4 000 r/min下離心5 min,取上清液經氮氣吹干,用初始流動相定容至1 mL,過0.45 μm濾膜,待測。

1.3儀器條件

1.3.1液相色譜條件

色譜柱:Platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫36 ℃;進樣量20 μL。熒光胺作為衍生試劑時激發(fā)波長為388 nm,發(fā)射波長為482 nm;鄰苯二甲醛作為衍生試劑時激發(fā)波長為290 nm,發(fā)射波長為396 nm;異硫氰酸熒光素作為衍生試劑時激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射波長為513 nm;2,3-萘二醛作為衍生試劑時激發(fā)波長為388 nm,發(fā)射波長為492 nm。流動相為0.3%(v/v)乙酸水溶液(A相)和甲醇(B相),梯度洗脫程序:0～22 min, 20%B～37%B; 22～35 min, 37%B～60%B; 35～40 min, 60%B～80%B; 40～45 min, 80%B～20%B。流速:0.7 mL/min。

1.3.2柱后衍生系統(tǒng)條件

熒光胺衍生試劑的流速為0. 15 mL/min,反應器溫度為50 ℃;鄰苯二甲醛衍生試劑的流速為0.15 mL/min,反應器溫度為100 ℃;異硫氰酸熒光素衍生試劑的流速為0.2 mL/min,反應器溫度為100 ℃; 2,3-萘二醛衍生試劑的流速為0.2 mL/min,反應器溫度為100 ℃。

2結果與討論

2.1樣品前處理方法的優(yōu)化

本文采用改良的QuEChERS法作為樣品前處理方式。根據(jù)磺胺類藥物的弱堿性和牛肉基質中主要含有脂肪、有機酸、生物胺等雜質的特點,選擇目前應用最廣泛的無水MgSO4、PSA、C18和GCB的組合作為分散吸附劑。在文獻配比[24]的基礎上設計并比較了5種組合吸附劑用量對回收率的影響:組合①為MgSO4750 mg、PSA 160 mg、C1825 mg和GCB 60 mg; ②為MgSO4750 mg、PSA 200 mg、C1850 mg和GCB 80 mg; ③為MgSO4750 mg、PSA 160 mg、C1825 mg和GCB 100 mg; ④為MgSO4750 mg、PSA 200 mg、C1825 mg和GCB 60 mg; ⑤為MgSO4750 mg、PSA 160 mg、C1850 mg和GCB 120 mg。由表1的結果可見:采用①、③、⑤組合,所有藥物的回收率均達到70%以上,其中組合③時大部分磺胺類藥物回收率均達在80%以上。且組合③能充分凈化雜質,使提取液澄清透明,因此牛肉樣品的凈化采用無水MgSO4750 mg、C1825 mg、PSA 160 mg和GCB 100 mg。

表 1　　　4種凈化劑的5種組合下16種磺胺類藥物的加標回收率

Group ①: 750 mg MgSO4, 160 mg PSA, 25 mg C18and 60 mg GCB. Group ②: 750 mg MgSO4, 200 mg PSA, 50 mg C18and 80 mg GCB. Group ③: 750 mg MgSO4, 160 mg PSA, 25 mg C18and 100 mg GCB. Group ④: 750 mg MgSO4, 200 mg PSA, 25 mg C18and 60 mg GCB. Group ⑤: 750 mg MgSO4, 160 mg PSA, 50 mg C18and 120 mg GCB.

2.2檢測方法的確定

2.2.1高效液相色譜-紫外檢測方法的建立

不同的磺胺類藥物極性差異較大,本文分析的16種磺胺類化合物,采用等度洗脫很難達到理想的分離效果,所以采用梯度洗脫方式,在多次摸索和優(yōu)化的基礎上建立了高效液相色譜分離條件。磺胺類藥物含有氨基而呈弱堿性,在流動相中加入少量的乙酸(0.3%(v/v))能促進磺胺類物質的電離,有助于色譜柱內硅醇基的質子化,減少磺胺與硅醇基間的相互作用,有效改善磺胺類藥物的分離效果及色譜峰形[25]。

2.2.2高效液相色譜-熒光檢測方法的優(yōu)化

本文采用的是在線柱后衍生的方法,16種磺胺藥物經色譜柱分離后進入柱后衍生系統(tǒng)與衍生試劑發(fā)生反應,根據(jù)不同衍生試劑衍生反應的條件,在已建立的色譜分離條件基礎上對衍生試劑流速、反應溫度及檢測波長進行優(yōu)化,優(yōu)化條件見1.3.2節(jié)。

圖 1　　　不同衍生化試劑衍生后16種磺胺類藥物的色譜圖Fig. 1　　　HPLC chromatograms of the 16 sulfonamides　　　with derivatization by different derivatization reagents　a. fluorescamine; b. OPA; c. fluorescein isothiocyanate isomer; d. 2,3-naphthalenedicarboxaldehyde.　1. SCM; 2. SDZ; 3. STZ; 4. SPD; 5. SM1; 6. SMT; 7. SM2; 8. SMP; 9. SMZ; 10. SMM; 11. SSX; 12. SBZ; 13. SPP; 14. SPZ; 15. SDM; 16. SQZ.

2.3熒光衍生試劑的比較與選擇

磺胺類藥物本身并無熒光特性,但其苯胺結構中的伯氨基較活潑,能與熒光衍生試劑反應生成具有熒光的物質。據(jù)文獻[26-28]報道,能與伯氨基快速反應的衍生試劑有熒光胺、鄰苯二甲醛、異硫氰酸熒光素和2,3-萘二醛。本文研究比較了這4種衍生化試劑衍生后的檢測結果(見圖1)。

圖1表明:用熒光胺作為衍生試劑時,16種磺胺類藥物均能快速發(fā)生衍生反應,且熒光衍生物響應值基本保持在同等水平,能夠獲得較為理想的色譜峰圖。當用OPA作為衍生試劑時,有14種磺胺類藥物能夠發(fā)生衍生反應但彼此之間響應值差異較大,不利于在同等水平下同時對14種磺胺類藥物進行分析檢測,其中磺胺噻唑和磺胺喹惡啉不能發(fā)生衍生反應或者響應值太小。用異硫氰酸熒光素作為衍生試劑時,16種磺胺類物質在色譜圖上均出現(xiàn)倒峰,異硫氰酸熒光素本身在最大激發(fā)波長490～495 nm,最大發(fā)射波長為520～530 nm時,就會呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,在上述分析條件下,會有一定的熒光響應值,與16種磺胺類藥物反應后產生熒光物質,響應值低于其本身的響應值,因而出現(xiàn)倒峰。且在幾次優(yōu)化檢測波長組合均未使倒峰翻轉。因此異硫氰酸熒光素不適合作為磺胺類成分的熒光衍生試劑。當使用2,3-萘二醛作為衍生試劑時,只有磺胺吡啶一種物質能夠發(fā)生衍生反應,因此其也不適合作為多種磺胺類物質柱后衍生熒光檢測分析中的衍生試劑。

表2進一步表明,從衍生反應效果看,用熒光胺衍生時,反應物的熒光響應值(色譜峰面積)較鄰苯二甲醛的衍生物提高了1～2個數(shù)量級,大大提高了檢測的靈敏度,這主要是因為熒光胺對芳香族胺具有特異性,與磺胺類藥物結合后產生高強度的熒光物質[25]。綜合上述兩個方面,熒光胺適合作為磺胺類藥物熒光檢測時的衍生試劑。

表 2　　　熒光胺和鄰苯二甲醛衍生16種磺胺類藥物的檢測結果比較

-: not detected.

2.4方法有效性研究

2.4.1方法的線性范圍、檢出限和定量限

將16種磺胺類藥物標準溶液逐級稀釋成不同的濃度,在優(yōu)化的色譜條件下分析。以峰面積(Y)為縱坐標,質量濃度(X, mg/L)為橫坐標,計算各磺胺類藥物的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍。同時通過牛肉空白基質考察檢出限和定量限,按3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算方法的檢出限和定量限。如表3所示,16種磺胺類藥物呈現(xiàn)良好的線性關系,相關系數(shù)(r)均大于0.992,且檢出限低,能夠滿足動物源性食品中磺胺類藥物殘留的檢測要求。

表 3　　　16種磺胺類化合物的線性關系、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

圖 2　　　(a)牛肉空白樣品及(b)加標樣品的色譜圖Fig. 2　　　HPLC chromatograms of (a) a blank beef 　　　sample and (b) a spiked beef sampleThe peak identifications are the same as in Fig. 1.

2.4.2方法的回收率與精密度

本文以不含上述16種磺胺類藥物的空白牛肉樣品為研究對象,在同樣的樣品前處理條件下進行16種磺胺類藥物的加標回收率及精密度試驗,得到牛肉空白樣品和加標樣品的色譜圖(見圖2),以此來考察方法的準確度和重現(xiàn)性。從空白和加標樣品的譜圖看,目標物與基質分離效果良好,基本不受基體雜質的影響。每個添加濃度平行5次測定,結果見表4。從表4可知,在3個加標濃度下,樣品的回收率在66.6%～109.5%之間,相對標準偏差(RSD)在0.9%～9.9%之間。由此可見本方法回收率高,有較好的重現(xiàn)性和精密度,能夠滿足動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的檢測要求。

2.5實際樣品的檢測

利用本研究建立的方法對購于青海省西寧市各超市及市場的10份牛肉樣品進行了16種磺胺類藥物的檢測,10份樣品中均未檢測到本文分析的16種磺胺類藥物殘留。

表 4　　　空白牛肉樣品中16種磺胺類藥物的加標回收率和精密度(n=5)

3結論

本研究根據(jù)牛肉樣品基質的性質及磺胺類藥物可與熒光衍生試劑結合產生高選擇性和熒光相應物質的特性,建立了牛肉中16種磺胺類藥物殘留量的改良QuEChERS-在線柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測分析方法。該法對原有的QuEChERS方法進行了改良,使其更適用于牛肉基質的凈化,不僅大大縮短了處理時間,提高了效率,且凈化效果好,待測物色譜圖中沒有雜峰干擾。采用在線柱后衍生,衍生反應效率高,具有良好的回收率,靈敏度和重現(xiàn)性好,且實用性和針對性強,能夠滿足食品安全檢測限量的要求,為動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的研究提供了經濟、簡便的分析檢測方法。

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Simultaneous determination of 16 sulfonamide residues in beef by high performance liquid chromatography-fluorescence detection with online post-column derivatization

XU Xu1,2, XIAO Yuancan1*, GENG Dandan1,2, PI Li1, DONG Qi1, HU Fengzu1*

(1. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810008, China;2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Abstract:In this study, we investigated the effects of the four kinds of derivatization reagents, including fluorescamine, o-phthaladehyde, fluorescein isothiocyanate isomer and 2,3-naphthalenedicarboxaldehyde. A high performance liquid chromatography with fluorescence detection method for the rapid determination of 16 sulfonamide residues in beef was developed by using improved QuEChERS method for sample pretreatment and fluorescamine for online post-column derivatization. The beef samples were extracted with acetonitrile containing 1%(v/v) acetic acid, cleaned-up by QuEChERS method, injected for online post-column derivatization with fluorescamine, and then analysed with fluorescence detection. Under the optimized conditions of QuEChERS and chromatography, the 16 sulfonamide residues showed good linearities in the range of 0.024-2.533 mg/L with the correlation coefficients (r) higher than 0.992. The limits of detection of the method were 1.6 to 8.2 μg/kg. The average recoveries of the 16 sulfonamide residues were in the range of 66.6%-109.5% with the relative standard deviations from 0.9% to 9.9%. The method has the advantages of rapidity, simplicity, high sensitivity and better purification effect. It is suitable for the rapid determination of the sulfonamide residues in beef.

Key words:QuEChERS; fluorescamine; online post-column derivatization; high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLR); sulfonamides; beef

中圖分類號:O658

文獻標識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)04-0422-07

基金項目:中國科學院儀器功能開發(fā)技術創(chuàng)新項目(Ig201308);中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KSCX2-EW-J-26);青海省科技計劃項目(2015-ZL-Y23);青海省科技平臺建設項目(2012-T-Y19).

*收稿日期:2015-11-12

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.11020

*通訊聯(lián)系人.Tel:(0971)6132750,E-mail:ycxiao@nwipb.cas.cn(肖遠燦);Tel:(0971)6132750,E-mail:hufz@nwipb.cas.cn(胡風祖).

Foundation item: Instrument Function Development and Technology Innovation Project of Chinese Academy of Sciences (No. Ig201308); Knowledge Innovative Program of Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-EW-J-26); Science and Technology Plan Project of Qinghai Province (No. 2015-ZL-Y23); Science and Technology Platform Construction Project of Qinghai Province (No. 2012-T-Y19).