全細(xì)胞的核酸適配體篩選的研究進(jìn)展

劉品多,　屈　鋒

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081)

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全細(xì)胞的核酸適配體篩選的研究進(jìn)展

劉品多,屈鋒*

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081)

摘要:核酸適配體(aptamer)是從人工合成的隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)或RNA文庫(kù)中篩選得到的,能夠高親和力、高特異性地與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA或RNA。核酸適配體的靶標(biāo)范圍廣,可包括小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、微生物等多種靶標(biāo)。其中以細(xì)胞為靶標(biāo)的適配體在生物感應(yīng)、分子成像、醫(yī)學(xué)診斷、藥物傳輸和疾病治療等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛能。但全細(xì)胞的核酸適配體篩選過(guò)程復(fù)雜,篩選難度大,篩選的適配體性能不佳是導(dǎo)致目前可用的適配體非常有限的主要原因。由于細(xì)胞表面蛋白質(zhì)在提取純化過(guò)程中分子結(jié)構(gòu)和形態(tài)會(huì)發(fā)生改變,故以膜表面蛋白質(zhì)為靶標(biāo)篩選的適配體很難應(yīng)用于識(shí)別整體細(xì)胞。以全細(xì)胞為靶標(biāo)的核酸適配體篩選則不需要準(zhǔn)確了解細(xì)胞表面的分子結(jié)構(gòu),篩選過(guò)程中可保持細(xì)胞的天然狀態(tài),以全細(xì)胞為靶標(biāo)篩選出的核酸適配體有望直接用于全細(xì)胞識(shí)別。本文總結(jié)了2008～2015年全細(xì)胞的核酸適配體篩選的研究進(jìn)展,介紹了靶細(xì)胞的分類、核酸庫(kù)的設(shè)計(jì)、篩選條件和方法以及核酸適配體的親和力表征方法等。并列出全細(xì)胞靶標(biāo)的核酸適配體序列。

關(guān)鍵詞:核酸適配體;細(xì)胞;篩選;指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù);綜述

核酸適配體是從人工合成的隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)或RNA文庫(kù)中篩選得到的以高親和力、高特異性與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA或RNA。核酸適配體通常由10～100個(gè)堿基組成,這些堿基可通過(guò)分子內(nèi)堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)如發(fā)夾(hairpin)、假結(jié)(pseudoknot)、G-四鏈體(G-quartet)等,或在靶標(biāo)的誘導(dǎo)下形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸適配體作為配體,其結(jié)合的靶標(biāo)范圍廣泛,包括離子、小分子、多肽、蛋白質(zhì)乃至完整的細(xì)胞和微生物。目前,由于缺乏可高效識(shí)別細(xì)胞表面分子的特異性工具,故對(duì)細(xì)胞表面的分子水平研究還受到很大的限制。而基于全細(xì)胞篩選的核酸適配體有望成為細(xì)胞的識(shí)別分子,用于對(duì)其進(jìn)行快速分析檢測(cè)。

以全細(xì)胞為靶標(biāo)的核酸適配體篩選(cell-SELEX,或whole cell-SELEX)并非針對(duì)細(xì)胞中分離純化出來(lái)的蛋白質(zhì)組分,而是以完整細(xì)胞為靶標(biāo),利用單鏈核酸與完整細(xì)胞表面的分子間的相互作用進(jìn)行分子識(shí)別?；谌?xì)胞的核酸適配體篩選,不需要準(zhǔn)確了解細(xì)胞表面的分子及其結(jié)構(gòu)信息,且篩選后的核酸適配體可直接用于全細(xì)胞識(shí)別。例如,通過(guò)Cell-SELEX有望篩選出可識(shí)別未分化和分化的細(xì)胞、正常細(xì)胞和癌細(xì)胞、感染和未感染的細(xì)胞等的適配體。因此全細(xì)胞的核酸適配體篩選及應(yīng)用對(duì)于疾病的診斷和治療有重要的研究意義和應(yīng)用前景。

全細(xì)胞核酸適配體的篩選及細(xì)胞識(shí)別研究促進(jìn)了核酸適配體在早期臨床診斷和疾病治療等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。譚蔚泓教授課題組在國(guó)際上率先開(kāi)始全細(xì)胞核酸適配體的研究,發(fā)表了一系列研究論文[1-8]和綜述[9-13]。近期出版的whole-cell-SELEX[14]一書(shū)系統(tǒng)總結(jié)了相關(guān)工作。他們通過(guò)cell-SELEX篩選出多種癌細(xì)胞的適配體,指出核酸適配體可用于特異性鑒別腫瘤類型,改進(jìn)腫瘤治療方法。通過(guò)辨識(shí)腫瘤細(xì)胞表面膜蛋白還可以發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物。此外,McKeague等[15]對(duì)1990～2013年公開(kāi)發(fā)表的2 334種適配體序列及相關(guān)文章做了一系列的統(tǒng)計(jì),包括核酸庫(kù)的類型、適配體長(zhǎng)度、靶標(biāo)種類、篩選條件及篩選方法等,其中以細(xì)胞為靶標(biāo)的適配體占到6%。Shamah等[16]總結(jié)的復(fù)合靶標(biāo)的篩選方法可以排除無(wú)特異性或低特異性的核酸序列。他們指出,一次實(shí)驗(yàn)中既可以篩選出特異性結(jié)合不同靶位的多種適配體,也可以篩選出對(duì)多種靶位有結(jié)合作用的同一個(gè)適配體。根據(jù)篩選目的的不同可應(yīng)用不同的復(fù)合篩選方法。趙仲麟等[17]綜述了cell-SELEX技術(shù)在活病原微生物、癌細(xì)胞、生物標(biāo)志物篩選等方面的進(jìn)展,還介紹了適配體用于細(xì)胞攝取藥物及給藥方式方面的研究。

與生物體內(nèi)的天然抗體相比,核酸適配體完全通過(guò)體外篩選獲得,可通過(guò)化學(xué)方法合成及修飾,實(shí)驗(yàn)成本低,無(wú)需動(dòng)物免疫及分離純化。核酸適配體有較好的組織滲透性,易進(jìn)入細(xì)胞,且無(wú)免疫原性。還可根據(jù)應(yīng)用條件篩選特定靶標(biāo)的適配體,通過(guò)篩選過(guò)程控制其與靶標(biāo)的親和力和特異性。已有研究表明,核酸適配體作為識(shí)別分子,在細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞成像、癌癥診斷和疾病治療等方面有廣闊的應(yīng)用前景,但因核酸適配體篩選過(guò)程復(fù)雜、繁瑣、人力和財(cái)力消耗大,實(shí)際篩選過(guò)程難度很大,篩選的成功率并不令人滿意。面對(duì)重大疾病的細(xì)胞識(shí)別和治療藥物發(fā)現(xiàn)的巨大需求,目前可用的核酸適配體還非常有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需求。而盲目地進(jìn)行核酸適配體篩選常常無(wú)功而返。已有多篇綜述重點(diǎn)介紹了2008～2015年全細(xì)胞的核酸適配體的研究進(jìn)展和應(yīng)用[1-13,16,17],但針對(duì)細(xì)胞的適配體篩選方法的總結(jié)和分析還少見(jiàn)報(bào)道。針對(duì)全細(xì)胞靶標(biāo)的適配體篩選方法進(jìn)行歸納總結(jié)無(wú)疑將為研究者提供系統(tǒng)的信息和參考,有助于提供適配體的篩選效率。本文重點(diǎn)針對(duì)細(xì)胞的核酸適配體的篩選方法進(jìn)行總結(jié),包括靶細(xì)胞的分類、核酸庫(kù)的設(shè)計(jì)、篩選條件和方法及核酸適配體的親和力表征方法等。另外總結(jié)了2008年以來(lái)全細(xì)胞篩選適配體序列(見(jiàn)表1)。

1靶細(xì)胞分類

癌癥是當(dāng)今世界第一大威脅人類生命健康的疾病,癌癥的診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)等一直是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難題。目前,以細(xì)胞為靶標(biāo)的適配體篩選主要針對(duì)不同類型的癌細(xì)胞,也有少量針對(duì)炎癥細(xì)胞、體內(nèi)正常細(xì)胞及感染細(xì)胞的篩選。

1.1癌細(xì)胞

針對(duì)人類各系統(tǒng),可將癌細(xì)胞進(jìn)行如下分類。

1.1.1呼吸系統(tǒng)癌細(xì)胞

呼吸系統(tǒng)的癌癥主要包括鼻咽癌、喉癌、氣管癌和肺癌,而肺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他幾種癌癥,是發(fā)病率和死亡率最高的癌癥種類。目前對(duì)呼吸系統(tǒng)癌細(xì)胞適配體的篩選也主要針對(duì)各類肺癌細(xì)胞。Kunii等[37]篩選出小細(xì)胞肺癌細(xì)胞SBC3的適配體,這種適配體與其他幾種肺癌細(xì)胞如DMS53、A549、NCI-H69及RERF-LC-MA的結(jié)合能力極低,說(shuō)明該適配體特異性極強(qiáng),有望用于肺癌類型診斷。Chen等[38]以小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H128為靶細(xì)胞篩選適配體。當(dāng)在人的全血中加入NCI-H128細(xì)胞,并與篩選出的適配體進(jìn)行孵育后,通過(guò)用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)適配體與全血中的NCI-H128細(xì)胞有結(jié)合力,表明該適配體可在人的血液環(huán)境中與NCI-H128細(xì)胞有較強(qiáng)的結(jié)合,說(shuō)明該適配體可用于血液環(huán)境中NCI-H128細(xì)胞的檢測(cè)。

表 1　　　細(xì)胞靶標(biāo)的適配體序列

1.1.2消化系統(tǒng)癌細(xì)胞

消化系統(tǒng)的癌癥包括食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和直腸癌等。胃癌、肝癌及結(jié)腸直腸癌等的適配體篩選均有報(bào)道。李真真等[39]通過(guò)鏈霉親和素磁珠分離和PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化,篩選出胃癌細(xì)胞SGC-7901的適配體。Ninomiya等[40]篩選了肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞適配體,該適配體與正常肝細(xì)胞不結(jié)合,在靶向治療肝癌時(shí)可避免傷及正常肝細(xì)胞,從而減少副作用。Li等[41]篩選出以轉(zhuǎn)移性直腸癌LoVo為靶細(xì)胞的適配體,并且在腫瘤切片上進(jìn)行原位雜交,結(jié)果表明該適配體對(duì)腫瘤細(xì)胞結(jié)合能力很強(qiáng),說(shuō)明該適配體具有靶向治療直腸癌的潛力。Li等[42]篩選出乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231適配體,為驗(yàn)證適配體的結(jié)合部位是膜表面蛋白,用胰蛋白酶進(jìn)行消化使細(xì)胞表面膜蛋白減少,將消化過(guò)的細(xì)胞與修飾熒光標(biāo)簽的適配體孵育,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光密度,結(jié)果顯示細(xì)胞經(jīng)消化后與適配體的結(jié)合力明顯下降,證明適配體是與細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合。Wu等[29]篩選出了胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)PL45細(xì)胞的高親和力和特異性的適配體。對(duì)荷瘤小鼠分別進(jìn)行靜脈注射適配體和核酸庫(kù)后,利用IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),僅需5 min適配體就可大量結(jié)合在腫瘤部位,說(shuō)明該適配體可以在體內(nèi)迅速結(jié)合到腫瘤,具有靶向治療腫瘤的潛力。Kim等[31]以過(guò)表達(dá)上皮黏附分子(EpCAM)的肝癌細(xì)胞HepG2為篩選細(xì)胞,以普通HepG2細(xì)胞為陰性細(xì)胞,篩選出EpCAM的適配體。因EpCAM為多種腫瘤細(xì)胞的生物標(biāo)志物,其適配體具有初步診斷癌癥的潛質(zhì)。Cao等[32]篩選了與胃癌細(xì)胞AGS的適配體。分別用AGS細(xì)胞、SW620細(xì)胞(直腸腺癌細(xì)胞)、HepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)對(duì)大鼠進(jìn)行荷瘤實(shí)驗(yàn),荷瘤成功后靜脈注射AGS適配體緩沖液,通過(guò)活體成像系統(tǒng)可見(jiàn)適配體與AGS細(xì)胞瘤體結(jié)合程度很高,而與其他兩種細(xì)胞瘤體幾乎沒(méi)有結(jié)合,證明該適配體對(duì)胃癌細(xì)胞AGS具有高親和力和高特異性,有望于胃癌細(xì)胞的識(shí)別。

1.1.3生殖系統(tǒng)癌細(xì)胞

男性和女性罹患的生殖系統(tǒng)癌癥分別主要為前列腺癌和宮頸癌及卵巢癌。針對(duì)卵巢癌及宮頸癌已篩選出多種相關(guān)癌細(xì)胞的適配體。Simaeys等[43]篩選的卵巢癌細(xì)胞TOV-21的適配體,不與卵巢癌細(xì)胞CAOV-3和宮頸癌細(xì)胞Hela結(jié)合,表明它對(duì)TOV-21有高特異性,在腫瘤早期診斷中有鑒別特定卵巢癌的潛力。Graham等[44]以未感染人乳頭瘤病毒的宮頸癌細(xì)胞Hela為靶細(xì)胞篩選的適配體,不能與感染此類病毒的宮頸癌細(xì)胞結(jié)合,因此,使用該適配體可以判斷癌癥的種類及癌癥亞型,有助于對(duì)患癌種類的預(yù)測(cè)。Benedetto等[24]篩選的針對(duì)惡性卵巢癌細(xì)胞Caov-3的高親和力適配體則對(duì)良性卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3沒(méi)有結(jié)合,故可用于卵巢癌良惡性的判斷。Lu等[28]篩選的乳腺癌干細(xì)胞Mammosphere適配體,與正常乳腺細(xì)胞MCF-A以及乳腺癌細(xì)胞MCF-7均無(wú)結(jié)合,具有診斷早期乳腺癌的應(yīng)用潛能。Hung等[45]建立芯片cell-SELEX(on-chip cell-SELEX)的方法,在磁珠表面修飾上皮細(xì)胞抗體并與靶細(xì)胞孵育,使磁珠能夠結(jié)合在靶細(xì)胞表面,結(jié)合磁珠的靶細(xì)胞與核酸庫(kù)孵育后,用磁珠分離出磁珠靶細(xì)胞適配體結(jié)合物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最終篩選出與卵巢癌細(xì)胞TOV21G具有高親和力的適配體。Li等[25]篩選出對(duì)乳腺癌SW620細(xì)胞有特異性識(shí)別的適配體,證明在4 ℃和37 ℃孵育時(shí),適配體與該細(xì)胞的結(jié)合無(wú)明顯差異。也有關(guān)于前列腺癌細(xì)胞的適配體篩選報(bào)道。Wang等[34]篩選的前列腺癌細(xì)胞PC3的適配體,對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721、宮頸癌細(xì)胞Hela及前列腺癌細(xì)胞22RV-1則沒(méi)有明顯的結(jié)合,證明該適配體與PC3細(xì)胞有高特異性識(shí)別,可望用于前列腺癌的早期鑒別診斷。

1.1.4血液系統(tǒng)癌細(xì)胞

血液系統(tǒng)的癌癥主要包括各類白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及惡性淋巴瘤。Sefah等[46]篩選出Hl60細(xì)胞的適配體,可用于急性骨髓性白血病的早期診斷。陳鑫等[47]用急性早幼粒白血病細(xì)胞NB4作靶細(xì)胞,以慢性髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為陰性細(xì)胞,篩選出NB4細(xì)胞適配體,該適配體能夠鑒別急性早幼粒白血病和慢性髓性白血病。

1.2炎癥細(xì)胞

炎癥是常見(jiàn)的基本病理過(guò)程,它與腫瘤及多種代謝類疾病如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。有效阻斷炎癥的發(fā)展通路是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。陳亮等[48]用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3作為靶細(xì)胞,以IL-17RA表達(dá)缺陷性的NIH3T3為陰性細(xì)胞,篩選了NIH3T3的適配體。他們的研究表明IL-17/IL-17RA介導(dǎo)的信號(hào)通路與炎癥因子IL-1、IL-6和IL-8的表達(dá)密切相關(guān),因此有可能利用該適配體治療骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。汪江波等[49]將THP-1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞,即以巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞作為靶細(xì)胞,以巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞作為陰性細(xì)胞,篩選出巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞適配體。由于巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化中最早出現(xiàn)的標(biāo)識(shí)性病理細(xì)胞,故利用其適配體有可能利用巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞作為動(dòng)脈粥樣硬化治療靶點(diǎn),該適配體有可能用于早期心腦血管的診斷和靶向治療。

1.3正常體細(xì)胞

篩選正常體細(xì)胞的適配體的意義在于可利用適配體追蹤體內(nèi)正常的生理過(guò)程及模擬病理過(guò)程,便于深入探討發(fā)病機(jī)理,尋找有效的防病治病方法。Liang等[26]篩選出成骨細(xì)胞的適配體,并將其制備成功能性脂質(zhì)納米微粒,探討了骨形成的相關(guān)機(jī)制。Zhou等[27]用表達(dá)CCR5的人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373-Magi-CCR5E細(xì)胞作為靶細(xì)胞,以不表達(dá)CCR5的U373-Magi細(xì)胞作為陰性細(xì)胞篩選出適配體,由于HIV病毒的結(jié)合位點(diǎn)為T(mén)細(xì)胞表面CCR5受體,如果該適配體能與CCR5結(jié)合,就能有效阻斷HIV病毒與T細(xì)胞的結(jié)合,該適配體作為藥物則具有治療艾滋病的潛力。Hou等[30]篩選出人類多能干細(xì)胞適配體,該適配體與幾種干細(xì)胞包括小鼠胚胎肝細(xì)胞、獼猴胚胎肝細(xì)胞、人胚胎肝細(xì)胞及人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞結(jié)合能力都很強(qiáng),但與幾種非干細(xì)胞包括人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、人胚胎成纖維細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞和人滋養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)合能力很弱,說(shuō)明該適配體能特異性地結(jié)合干細(xì)胞而不能結(jié)合已分化細(xì)胞,對(duì)研究干細(xì)胞的分化過(guò)程有很大幫助。Zhao等[35]以CD4陽(yáng)性T細(xì)胞Karpas 299為靶細(xì)胞,以不表達(dá)CD4的B淋巴細(xì)胞CA46為陰性細(xì)胞篩選出的適配體可與CD4因子結(jié)合,因而阻礙GP120病毒與CD4的結(jié)合,從而防止對(duì)GP120病毒的感染。Kim等[36]篩選成熟了的白色脂肪細(xì)胞的適配體,因白色脂肪細(xì)胞的主要功能是儲(chǔ)存體內(nèi)多余的脂肪,若將該適配體與藥物分子連接,再結(jié)合到脂肪細(xì)胞,則有望有效治療肥胖病。

1.4感染細(xì)胞

近年來(lái),全球傳染病流行態(tài)勢(shì)十分嚴(yán)峻。傳染病仍對(duì)人類健康構(gòu)成很大威脅。特別是不少傳染病以暴發(fā)流行的形式出現(xiàn),在短期內(nèi)可使數(shù)以千計(jì)的人罹患或死亡。因此研究有效防止傳染病疾病的形成十分必要。當(dāng)細(xì)胞受到病毒或病原微生物感染后,細(xì)胞膜表面的某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化。篩選感染細(xì)胞的適配體對(duì)于診斷一些有潛伏期的傳染性疾病具有重大意義。Birch等[50]建立慣性微流SELEX(i-SELEX)的方法,即基于慣性聚焦螺旋微流控通道,運(yùn)用慣性將細(xì)胞和未與細(xì)胞結(jié)合的核酸分離,篩選出被惡性瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞的適配體,這種適配體對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的有效識(shí)別對(duì)于瘧疾的診斷和治療有重大意義。篩選感染細(xì)胞的適配體時(shí),通常選擇受感染的細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞,而將同類型的非感染的細(xì)胞作為陰性細(xì)胞用于負(fù)篩選。有時(shí)也可選用未感染細(xì)胞為靶細(xì)胞而將感染的細(xì)胞作為陰性細(xì)胞,如Graham等[44]選用未被人乳頭瘤病毒感染的宮頸癌細(xì)胞為靶細(xì)胞,而將易感細(xì)胞作為陰性細(xì)胞,篩選出未感染人乳頭瘤病毒的宮頸癌細(xì)胞的適配體。該適配體不能與感染了此類病毒的宮頸癌細(xì)胞結(jié)合,可用于宮頸癌早期診斷中鑒別宮頸癌細(xì)胞是否被乳頭瘤病毒感染。

2核酸庫(kù)的設(shè)計(jì)

針對(duì)細(xì)胞篩選時(shí)所用的核酸庫(kù)與其他靶標(biāo)所用的核酸庫(kù)相似,也是由大量隨機(jī)合成的單鏈DNA或RNA分子序列組成。理論上,一定堿基數(shù)的核酸庫(kù)中存在的核酸分子序列應(yīng)有4n種。這些單鏈DNA或RNA鏈的兩端含有引物序列,中間為隨機(jī)序列。隨機(jī)序列長(zhǎng)度一般為15～80 mer。兩端的引物長(zhǎng)度總和為30～50 mer。與蛋白質(zhì)和小分子靶標(biāo)篩選適配體不同,全細(xì)胞篩選時(shí),細(xì)胞與核酸序列的結(jié)合位點(diǎn)具有不確定性,因此篩選所用的核酸庫(kù)通常未對(duì)單鏈DNA或RNA的骨架進(jìn)行過(guò)修飾,以減少篩選試驗(yàn)成本。

3篩選條件和方法

細(xì)胞是由多種生物大分子和小分子組成、能夠進(jìn)行新陳代謝的生命體。細(xì)胞膜表面包含蛋白質(zhì)、多糖、脂類等多種物質(zhì),也會(huì)因周?chē)h(huán)境變化而做出一定的形態(tài)變化。全細(xì)胞作為適配體篩選的靶標(biāo),它的復(fù)雜成分和生物活性導(dǎo)致全細(xì)胞篩選過(guò)程復(fù)雜、難度大。細(xì)胞在生物體內(nèi)處在一個(gè)復(fù)雜的新陳代謝環(huán)境中,溫度為37 ℃左右。但目前報(bào)道的篩選過(guò)程多在體外進(jìn)行,因此篩選出的適配體有可能不會(huì)在體內(nèi)環(huán)境下有效識(shí)別和結(jié)合靶細(xì)胞,從而導(dǎo)致篩選出的適配體性能變差。細(xì)胞表面的很多蛋白質(zhì)種類相同,篩選出的適配體如果結(jié)合了非某種細(xì)胞特定的蛋白質(zhì),則不能保證適配體的特異性。為了解決這個(gè)問(wèn)題,在篩選過(guò)程中需加入負(fù)篩選的步驟。根據(jù)McKeague等[15]統(tǒng)計(jì)的1990年以來(lái)的細(xì)胞靶標(biāo)適配體的篩選僅占6%,下文中將系統(tǒng)介紹篩選過(guò)程,并對(duì)重要條件進(jìn)行討論。

全細(xì)胞適配體篩選過(guò)程包括幾個(gè)步驟:核酸庫(kù)與靶細(xì)胞的孵育,離心分離細(xì)胞與未結(jié)合的核酸序列,洗脫結(jié)合在細(xì)胞上的核酸序列,對(duì)這些結(jié)合序列進(jìn)行負(fù)篩選。將負(fù)篩選后得到的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到次級(jí)庫(kù)用于下輪篩選。次級(jí)庫(kù)通過(guò)上述循環(huán)進(jìn)行多輪篩選。將最后篩選的具有高親和力的核酸序列測(cè)序,即得到適配體。其中負(fù)篩選的過(guò)程是可與靶標(biāo)結(jié)合的序列與陰性細(xì)胞孵育,目標(biāo)是去掉同時(shí)可與陰性細(xì)胞結(jié)合的核酸序列,以提高篩選序列的特異性。是否進(jìn)行負(fù)篩過(guò)程,需要根據(jù)具體篩選的目的決定。最后篩選出的適配體還需要進(jìn)行親和力測(cè)定。根據(jù)篩選流程,下面重點(diǎn)介紹孵育條件、負(fù)篩選和分離方法。

3.1孵育條件

目前,絕大多數(shù)細(xì)胞靶標(biāo)與適配體是在4 ℃孵育。Shamah等[16]提到4 ℃下可減少適配體的降解,而37 ℃篩選出的適配體結(jié)合能力更低。但Sefah等[46]則認(rèn)為4 ℃下篩選的適配體在人體體溫條件下結(jié)合能力會(huì)下降,因此應(yīng)在37 ℃下篩選適配體。而Simaeys等[43]則通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明兩個(gè)溫度下篩選出的適配體的結(jié)合能力并無(wú)明顯差異。理論上,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)隨溫度有所變化,但具體的變化程度因蛋白質(zhì)而異,并不相同。由于全細(xì)胞適配體篩選并不針對(duì)具體的某種蛋白質(zhì),因此認(rèn)為適配體結(jié)合的蛋白質(zhì)在溫度變化下結(jié)構(gòu)改變很小,故篩選溫度的影響可忽略不計(jì)。但如果已知適配體結(jié)合的蛋白質(zhì)在不同溫度時(shí)結(jié)構(gòu)變化較大,則篩選溫度會(huì)對(duì)其有很大的影響,應(yīng)予以關(guān)注。4 ℃時(shí),核酸的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,孵育時(shí)間可設(shè)置0.5～2 h不等。而37 ℃時(shí)核酸易降解,孵育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),通常為0.5 h。

由于操作簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)成本低,適配體與靶細(xì)胞孵育通常在體外進(jìn)行。但也有將核酸庫(kù)注入小鼠體內(nèi),研究其結(jié)合作用。Mi等[51]在小鼠肝臟內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞做成移植肝癌小鼠,飼養(yǎng)12天后,通過(guò)靜脈注射隨機(jī)RNA庫(kù),RNA長(zhǎng)度為80 mer,20 min后處死小鼠取出瘤體,分離與瘤體結(jié)合的RNA分子,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增,再將次級(jí)庫(kù)注射到抑制肝癌小鼠體內(nèi),經(jīng)過(guò)多輪篩選最終得到適配體。體內(nèi)篩選的最大的優(yōu)勢(shì)在于核酸適體可直接識(shí)別原位的潛在靶細(xì)胞,篩選在生理環(huán)境下進(jìn)行,篩選出的適配體便于實(shí)際應(yīng)用。因此,通過(guò)體內(nèi)篩選開(kāi)發(fā)的高親和力和高特異性的核酸適配體,可用于鑒別不同組織及抑制體內(nèi)靶細(xì)胞中特定靶分子,該種篩選方法具有極其重要的應(yīng)用前景。

3.2負(fù)篩選

在靶細(xì)胞外選擇其他細(xì)胞作為負(fù)篩選的陰性對(duì)照細(xì)胞,目的是除去非特異性結(jié)合的核酸序列,有效提高靶細(xì)胞的適配體的特異性。負(fù)篩選的陰性細(xì)胞要根據(jù)靶細(xì)胞的環(huán)境條件及篩選目的進(jìn)行選擇。已知靶細(xì)胞表面具有某些特定蛋白質(zhì)時(shí),需要選擇不含這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞類型。如Kim等[31]以過(guò)表達(dá)上皮黏附分子(EpCAM)的肝癌細(xì)胞HepG2作為靶細(xì)胞,而以普通HepG2細(xì)胞作為陰性細(xì)胞。篩選特定癌細(xì)胞類型時(shí),需要選擇人體同一系統(tǒng)的其他癌細(xì)胞作為陰性細(xì)胞。如陳鑫等[47]用急性早游離白血病細(xì)胞NB4細(xì)胞作為篩選細(xì)胞,以慢性髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞作為陰性細(xì)胞。

3.3分離方法

細(xì)胞的適配體篩選主要采用離心分離,此外還有鏈霉親和素磁珠分離法和慣性微流SELEX(i-SELEX)的方法。

離心法因操作簡(jiǎn)單而應(yīng)用最普遍。先采用低速離心(1 000 r/min),使靶細(xì)胞和結(jié)合核酸物沉降,棄去未結(jié)合核酸的上清液。沉降物中加入緩沖液后置于94 ℃水浴中10 min,隨后再通過(guò)高速離心(12 000 r/min),收取上清液,即為與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸。該核酸擴(kuò)增后作為次級(jí)庫(kù)用于后續(xù)篩選。鏈霉親和素磁珠法多用于蛋白質(zhì)篩選,但也可用于全細(xì)胞適配體篩選,如Hung等[50]在建立芯片cell-SELEX的方法中,采用了聯(lián)袂親和素磁珠法分離靶細(xì)胞核酸結(jié)合物。具體為在磁珠表面修飾上皮細(xì)胞抗體,該抗體能與靶細(xì)胞特異性結(jié)合,從而在與靶細(xì)胞孵育后,磁珠能結(jié)合在靶細(xì)胞表面。當(dāng)結(jié)合磁珠的靶細(xì)胞與核酸庫(kù)孵育后,用磁珠分離出磁珠靶細(xì)胞適配體結(jié)合物。微流SELEX[50]分離方法是建立聚焦螺旋微流控通道,當(dāng)靶細(xì)胞結(jié)合適配體后質(zhì)量發(fā)生變化,運(yùn)用慣性將靶細(xì)胞核酸結(jié)合物與未結(jié)合細(xì)胞的核酸分離,該方法的優(yōu)勢(shì)在微流控通道中可以運(yùn)行單個(gè)細(xì)胞,有利于后續(xù)的收集及PCR擴(kuò)增。

4細(xì)胞適配體的親和力表征方法

篩選的細(xì)胞的適配體需要表征其親和力。重要表征方法有流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡檢測(cè),此外還有活體成像系統(tǒng)。

利用流式細(xì)胞儀是全細(xì)胞適配體篩選中最常用的表征法。它的優(yōu)勢(shì)在于能夠計(jì)算出靶細(xì)胞與適配體結(jié)合的平衡解離常數(shù),一般用于檢測(cè)最后篩選出的適配體與靶細(xì)胞的結(jié)合能力。利用共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡可定性地觀察適配體與靶細(xì)胞及其他對(duì)照細(xì)胞的結(jié)合能力,可用來(lái)檢測(cè)適配體的特異性,由于操作相對(duì)簡(jiǎn)單,一般用于篩選過(guò)程中每一輪篩選結(jié)束后檢測(cè)次級(jí)庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合能力,以此決定篩選何時(shí)終止,或是檢測(cè)最終篩選出的適配體與靶細(xì)胞的親和力和適配體與其他幾種細(xì)胞的親和力進(jìn)行對(duì)比?；铙w成像系統(tǒng)主要用于直接檢測(cè)體內(nèi)的核酸適配體,可以通過(guò)圖像直接觀察適配體結(jié)合到腫瘤的過(guò)程，具體操作過(guò)程是將帶有熒光標(biāo)簽的適配體溶液靜脈注射到荷瘤大鼠或小鼠體內(nèi),將大鼠或小鼠放置在儀器內(nèi),然后觀察屏幕上的圖像,能夠直接觀測(cè)到適配體與腫瘤的結(jié)合速度和親和力大小。

5總結(jié)與展望

利用全細(xì)胞的適配體的細(xì)胞識(shí)別作用,可在生物傳感、分子成像、臨床診斷、藥物傳輸和疾病治療等領(lǐng)域有很大的發(fā)展空間。針對(duì)目前的適配體篩選的低效率等瓶頸問(wèn)題,有必要對(duì)篩選過(guò)程和篩選機(jī)理進(jìn)一步研究。由于細(xì)胞表面的膜蛋白或多肽具有特殊的形態(tài),將這些膜蛋白或多肽分離純化后進(jìn)行適配體篩選,無(wú)疑它們的形態(tài)會(huì)有所改變,不同于它們?cè)诩?xì)胞表面時(shí)的天然形態(tài),因此提取細(xì)胞表面蛋白質(zhì)后篩選的適配體有可能在實(shí)際細(xì)胞檢測(cè)中是無(wú)效。而用全細(xì)胞靶標(biāo)篩選適配體,針對(duì)完整細(xì)胞的天然形態(tài)和表面分子結(jié)構(gòu)的篩選條件和環(huán)境更接近實(shí)體狀態(tài),有助于篩選的適配體在實(shí)際環(huán)境下的應(yīng)用。全細(xì)胞的適配體大部分用于活體生命,而篩選過(guò)程則在體外進(jìn)行。為提高篩選成功率和實(shí)際的可應(yīng)用性,篩選過(guò)程應(yīng)盡量接近體內(nèi)環(huán)境。相比體外篩選,體內(nèi)環(huán)境下進(jìn)行適配體篩選則能夠完全模擬適配體識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)的過(guò)程,更有利于實(shí)際應(yīng)用,但現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道很少。目前的全細(xì)胞適配體篩選報(bào)道雖日漸增多,但在實(shí)際應(yīng)用中還面臨親和力和特異性以及穩(wěn)定性不好等不足。探索和建立高效、實(shí)用的全細(xì)胞適配體篩選方法十分必要,還需進(jìn)一步深入進(jìn)行研究。

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Research advances of aptamer selection for whole cell

LIU Pinduo, QU Feng*

(School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)

Abstract:Aptamers are single stranded DNA (ssDNA) or RNA that may bind to small molecules, proteins, cells, microorganisms, and other targets. Typically, aptamers are generated by a selection process referred to as systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Aptamers that bind with high affinity and specificity to proteins that reside on the cell surface have potential utility in the fields of biosenser, molecular imaging, medical diagnosis, drug delivery, and disease treatment. However, till now, available aptamers are very limited mainly due to the complex and difficulty screening of aptamer and their poor properties. Using purified cell surface proteins as target has the disadvantage of changing structure. When target proteins are present in a modified state, the isolated aptamers might not recognize the natural structure of some proteins. Aptamers screening targeting whole cell has the potential to be used as cell probe for directing whole cell analysis. It does not need to understand the molecular structure of the cell surface protein and maintain the natural state of cells in the screening process. This review mainly focuses on the advances of aptamer selection for whole cell from 2008 to 2015. The contents include the classification of target cells, design of library, methods for cell-ssDNA complex separation and affinity characterization. The sequences of aptamers reported are listed.

Key words:aptamers; cells; selection; systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX); review

中圖分類號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)04-0382-07

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21175011,21375008);國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB910603).

*收稿日期:2015-12-14

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.12015

多尺度靶標(biāo)的核酸適配體篩選研究進(jìn)展專欄

·專論與綜述

*通訊聯(lián)系人.Tel:(010)68918015,E-mail:qufengqu@bit.edu.cn.

Foundation item: National Nature Science Foundation of China (Nos. 21175011, 21375008); National “973” Project (No. 2012CB910603).