基于質(zhì)譜技術(shù)的磷酸化蛋白/多肽分離富集、鑒定及組學(xué)研究

龍星宇,　練鴻振

(生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心, 江蘇 南京 210023)

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聚焦

基于質(zhì)譜技術(shù)的磷酸化蛋白/多肽分離富集、鑒定及組學(xué)研究

龍星宇,練鴻振*

(生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心, 江蘇 南京 210023)

蛋白質(zhì)的磷酸化是生物體內(nèi)一種廣泛的、重要的翻譯后修飾形式,調(diào)控著細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、分子識(shí)別、新陳代謝等細(xì)胞過(guò)程。在生物體液或組織中,許多低豐度的磷酸化蛋白/多肽是具有高度特異性的生物臨床標(biāo)志物,這些生物分子可能為許多疾病的診斷和病理研究提供重要信息,因此對(duì)其進(jìn)行分析具有重要意義。近些年該研究熱點(diǎn)備受廣大分析工作者的青睞[1,2]。本文基于2016年1～2月主流期刊最新錄用和在線發(fā)表的基于質(zhì)譜技術(shù)的磷酸化蛋白/多肽相關(guān)論文,從生物分離和富集、磷酸化位點(diǎn)識(shí)別和鑒定及組學(xué)研究等方面,討論該研究領(lǐng)域的最新動(dòng)態(tài)和進(jìn)展。

1磷酸化蛋白/多肽的分離和富集研究

質(zhì)譜是磷酸化蛋白/多肽分析最為常用的工具,但磷酸化肽天然豐度低、離子化效率低且易受其他非磷酸化肽段的干擾,使得其選擇性富集成為質(zhì)譜分析前的必要步驟。從2015年發(fā)表的專(zhuān)門(mén)涉及新型親和材料對(duì)磷酸化肽富集的文獻(xiàn)綜述[3]來(lái)看,設(shè)計(jì)和發(fā)展新型納米結(jié)構(gòu)功能材料作為固相萃取基質(zhì)或功能載體,實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽有效富集,仍然是目前該領(lǐng)域的主要發(fā)展方向之一。

Liu課題組[4]按照他們自己新構(gòu)建的雙模板對(duì)接導(dǎo)向分子印跡(dual-template docking oriented molecular imprinting, DTD-OMI)策略,制備出磷酸鹽印跡的介孔硅納米材料(mesoporous silica nanoparticles, MSNs),并構(gòu)建離線平臺(tái),成功地應(yīng)用于β-酪蛋白、脫脂牛奶中的磷酸化肽富集,用于MALDI-TOF MS分析。材料制備主要包括以下3個(gè)步驟:(1)雙模板化合物的形成,即磷酸鹽(印跡模板)通過(guò)靜電吸引連接桿狀的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)膠粒(介孔模板); (2)導(dǎo)向模板,引入四乙氧基硅烷(TEOS)和脲丙基三乙氧基硅烷(UPTES)混合物作為合適的Si源前驅(qū)體,形成介孔硅納米材料;(3)模板移除,即介孔模板和印跡模板的移除。該材料展現(xiàn)出對(duì)磷酸化肽優(yōu)異的選擇性、抗干擾強(qiáng)、吸附平衡快速、吸附容量大等特點(diǎn),可以作為選擇性富集磷酸化肽的理想吸附劑,還可以應(yīng)用于其他生物樣品中蛋白磷酸化分析。

陽(yáng)離子交換色譜(AEX)是一種基于色譜技術(shù)富集磷酸化肽的有效方法,但相對(duì)于固定金屬離子親和色譜(IMAC)和金屬氧化物親和色譜(MOAC),探究AEX柱材料應(yīng)用于磷酸化肽高特異性富集的研究較少。Feng課題組[5]成功制備了磁性的石墨氮化碳(magnetic graphitic carbon nitride(g-C3N4), MCN)材料,并將其引入AEX技術(shù),應(yīng)用于磷酸化肽富集。由于材料表面富含N,能維持其基本性能以及具有豐富的結(jié)合位點(diǎn),在pH低至1.8時(shí),磷酸化肽仍表現(xiàn)出優(yōu)異的保留行為。得益于在如此低的pH條件下強(qiáng)的結(jié)合力,MCN材料展現(xiàn)出卓越的選擇性,能夠從標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物和脫脂牛奶的胰酶解液、人體血清中特異性捕獲磷酸化肽。他們還將MCN材料應(yīng)用于從鼠腦裂解液中選擇性富集磷酸化肽,并且成功地鑒定了2 576條獨(dú)特的磷酸化肽。此外,這種MCN材料還有可能應(yīng)用于催化、傳感等領(lǐng)域。

Krenkova等[6]基于鈦氧化物或鋯氧化物的無(wú)機(jī)納米纖維材料(inorganic nanofibrous),從兩種酪蛋白(α-/β-)酶解液中,選擇性地高效富集磷酸化肽并通過(guò)MALDI/MS分析檢測(cè)。他們采用掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線衍射儀(XRD)和比表面積測(cè)定技術(shù)，對(duì)用高速離心紡絲技術(shù)(force-spinning)制備的ZrO2納米纖維、商品化的銳鈦礦型和金紅石相TiO2材料進(jìn)行了表征。在相同的容量條件下,所制備的納米纖維狀材料相比普通的球形材料,磁導(dǎo)率增加近兩個(gè)數(shù)量級(jí),展現(xiàn)出更高的磁導(dǎo)率,而且其滲透性大大增強(qiáng)。這些材料不僅可以對(duì)樣品進(jìn)行成批處理,而且還可以用作裝柱填料;與傳統(tǒng)裝柱材料相比,無(wú)需高壓就可以用來(lái)填充移液管吸頭尖端。該納米纖維材料還可以通過(guò)裝柱內(nèi)嵌入HPLC自動(dòng)化系統(tǒng),用于復(fù)雜生物類(lèi)樣品,如細(xì)胞裂解液的分析,具有廣闊的應(yīng)用前景。

Piovesana等[7]以硫酸亞鐵銨和硫酸鐵作為Fe2+/Fe3+源,通過(guò)共沉淀法制備出Fe3O4磁球,在外包覆一層聚多巴胺(PDA),再將Ti4+固定到PDA包裹的磁球表面,得到的Fe3O4@PDA-Ti4+可用于磷酸化肽的磁固相萃取及nanoHPLC-MS/MS分析,通過(guò)優(yōu)化上樣與洗脫條件,提高磷酸化肽的回收率和富集選擇性,該操作與典型的鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程相兼容。同時(shí),他們還考察了未固定Ti4+的Fe3O4@PDA材料對(duì)模擬樣液(酪蛋白∶牛血清白蛋白, 1∶100)中磷酸化肽富集的對(duì)照實(shí)驗(yàn),根據(jù)肽段的平均親水性(grand average of hydropathy, GRAVY),離析的大多數(shù)是親水肽。研究結(jié)果表明,PDA能夠減少非特異性結(jié)合,并優(yōu)先與親水肽結(jié)合,是極性翻譯后修飾的一個(gè)理想支持底物,可以應(yīng)用于實(shí)際復(fù)雜樣品中磷酸化肽分析。

蛋白質(zhì)的糖基化也是蛋白質(zhì)的一個(gè)非常重要的修飾過(guò)程,用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。但大多數(shù)研究者都只是單獨(dú)地研究糖基化或磷酸化蛋白質(zhì)的富集,沒(méi)有建立對(duì)二者同時(shí)選擇性富集的方法。Wang等[8]以聚丙烯腈(polyacrylonitrile, PAN)為前體,溫和地合成了聚偕胺肟(polyamidoxime, co-PAN),該材料具有固定的親水骨架和活性長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu),能夠成功地應(yīng)用于糖肽的選擇性富集;他們進(jìn)一步將Ti4+固定到co-PAN微球表面得到co-PAN@Ti4+材料,有效地富集了磷酸化肽,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)肽混合物和人體血清樣評(píng)估了該聚合物材料的性能,實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖肽和磷酸化肽有順序的、選擇性的高效富集。材料重復(fù)使用5次后,依舊保持很好的富集效率(>70%),這一聚合物材料對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2蛋白磷酸化位點(diǎn)鑒定

蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是一個(gè)可逆過(guò)程,對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)鑒定和定量分析,有助于闡明蛋白質(zhì)磷酸化的機(jī)制與功能。

Mansuri等[9]通過(guò)對(duì)原生生物痢疾變形蟲(chóng)的吞噬作用研究,證實(shí)了該吞噬作用與一種非典型的蛋白激酶EhAK1有關(guān),具體是EhAK1與EhCaBP1相互作用被招募至吞噬杯的過(guò)程。進(jìn)一步研究表明,EhAK1通過(guò)多重機(jī)制包括G-肌動(dòng)蛋白磷酸化作用來(lái)控制肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)。生化分析結(jié)果揭示,EhAK1是一種廣譜的離子特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶,能夠經(jīng)歷多重反式自身磷酸化反應(yīng)酶解成多肽,無(wú)需其他底物。將EhAK1直接與三磷酸腺苷(ATP)在磷酸鹽緩沖液中孵育,經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析,鑒定出了3個(gè)自身磷酸化位點(diǎn)(Ser 54、Ser 398和Thr 279)。

Ollikainen等[10]建立了一種微芯片電泳(microchip electrophoresis, MCE)方法,通過(guò)芯片上的電噴霧離子化(ESI)技術(shù)將樣品引入質(zhì)譜,實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的同分異構(gòu)體的在線快速分離分析。而且,該方法可以在1 min內(nèi)把相同氨基序列、不同位置異構(gòu)的兩條單磷酸化肽(IR1A, TRDIpYETDYYRK和IR1B, TRDIYETDpYYRK)和一條三磷酸化肽(IR3 TRDIpYETDpYpYRK)從胰島素受體的其他非磷酸化肽中分離出來(lái)。在分析前,進(jìn)一步對(duì)單磷酸化肽(IR1A和IR1B)進(jìn)行芴甲基試劑(氯甲酸酯(Fomoc-Cl)或N-琥珀酰亞胺碳酸酯(Fomoc-OSu))衍生化處理,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)IR1A和IR1B的分離,進(jìn)而提高分離效率。研究結(jié)果表明,衍生化處理不僅可以提高單磷酸化肽的位置異構(gòu)的分離效率,還可以通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)來(lái)對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。

3磷酸化蛋白/多肽的組學(xué)研究

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白或單一蛋白質(zhì)進(jìn)行研究,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足蛋白質(zhì)多樣性和復(fù)雜性分析的需要,必須對(duì)磷酸化蛋白/多肽采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行高通量的組學(xué)研究。

Zarei等[11]通過(guò)組合靜電斥力-親水相互作用色譜(ERLIC)和強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)兩種不同的色譜技術(shù),結(jié)合固相萃取對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究?；陔牡膬煞N相反的理化性質(zhì),順序偶聯(lián)兩種不同的色譜技術(shù),從而提高對(duì)多磷酸化肽的分餾效率。具體步驟分為兩步:第一步,由于多磷酸化肽磷酸化位點(diǎn)帶有大量的負(fù)電荷,受靜電斥力-親水相互作用而被分離;第二步,從ERLIC流出的單磷酸化肽因帶正電荷,經(jīng)過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換后而離析。這一策略提供了一種強(qiáng)有力的、簡(jiǎn)單快速實(shí)現(xiàn)磷酸化肽初步分餾的方法,整個(gè)工作流程僅需2 h就可完成,而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、適應(yīng)性強(qiáng)(樣品量多量少皆可),還可實(shí)現(xiàn)多通道樣品制備。

斑馬魚(yú)常常作為動(dòng)物模型來(lái)研究脊椎動(dòng)物發(fā)育及器官形成。近期研究表明,將近70%的人類(lèi)基因組與斑馬魚(yú)基因組相似,而且,84%引起人類(lèi)疾病的基因與斑馬魚(yú)基因相同。Kwon等[12]根據(jù)斑馬魚(yú)胚胎的透明性、個(gè)體大和成型快速等特點(diǎn),采用TiO2從其胰酶解液中選擇性富集磷酸化肽,并對(duì)其蛋白質(zhì)組學(xué)的整體磷酸化模式進(jìn)行RP-LC-MS/MS研究。在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中,他們從2 166個(gè)磷酸化蛋白中鑒定出3 500個(gè)不重復(fù)的磷酸化位點(diǎn)以及1 564個(gè)磷酸化蛋白進(jìn)行定量化。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)分布規(guī)律分別為88.9%、 10.2%和0.9%。通過(guò)Motif-X分析對(duì)可能的激酶模體(Motif)進(jìn)行預(yù)測(cè),在80%已鑒定的磷酸化位點(diǎn)中,脯氨酸定向模體出現(xiàn)最頻繁,其次是pSF模體。上述工作基于斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的動(dòng)態(tài)模式創(chuàng)建了6個(gè)磷酸化蛋白簇。目前該研究提供了最大規(guī)模的斑馬魚(yú)胚胎磷酸化蛋白數(shù)據(jù),還展現(xiàn)了對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中磷酸化位點(diǎn)和磷酸化蛋白動(dòng)力學(xué)作進(jìn)一步研究的前景。

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特別策劃: 多尺度靶標(biāo)的核酸適配體篩選研究進(jìn)展專(zhuān)欄

引言

核酸適配體特指具有分子識(shí)別功能的短序列的單鏈核酸,也被稱(chēng)為“化學(xué)抗體”。它既有可與抗體相當(dāng)?shù)挠H和力和特異性,又有明顯優(yōu)于抗體的特點(diǎn):可通過(guò)化學(xué)合成制備,無(wú)需動(dòng)物免疫,成本低;分子性質(zhì)穩(wěn)定,能可逆變性與復(fù)性,易儲(chǔ)存運(yùn)輸;分子量小,易穿過(guò)細(xì)胞膜,免疫原性低,無(wú)明顯的毒副作用;靶標(biāo)范圍廣泛,包括金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和微生物等。Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,僅2010年以來(lái)就有超過(guò)5 300篇核酸適配體論文發(fā)表,涉及生物醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、分析化學(xué)、材料化學(xué)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域。核酸適配體研究具有交叉學(xué)科特色,與核酸適配體應(yīng)用相關(guān)的食品、環(huán)境和生物分析檢測(cè),以及核酸適配體在疾病診斷和治療、藥物研發(fā)和分子成像領(lǐng)域的應(yīng)用潛力正吸引多學(xué)科領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注。我國(guó)學(xué)者在核酸適配體研究領(lǐng)域取得大量處于世界前列的研究成果。2009年以來(lái),約300個(gè)核酸適配體相關(guān)項(xiàng)目獲國(guó)家重大研究計(jì)劃以及國(guó)家自然科學(xué)基金資助。近3年來(lái),在生物、醫(yī)學(xué)、中醫(yī)藥、環(huán)境和食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的核酸適配體相關(guān)應(yīng)用研究也在快速增加。

縱觀核酸適配體25年的發(fā)展,已報(bào)道的靶標(biāo)超過(guò)500種,篩選出的核酸適配體超過(guò)2 300種。但大量的研究和應(yīng)用主要集中于一些常見(jiàn)的靶標(biāo)和特定的核酸適配體。令人滿意的具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的核酸適配體數(shù)目還非常有限。研究者普遍的共識(shí)是,核酸適配體的篩選過(guò)程復(fù)雜,篩選效率低,且缺少標(biāo)準(zhǔn)化的方法表征適配體的功能,這是目前制約核酸適配體廣泛應(yīng)用的兩個(gè)瓶頸。

本課題組長(zhǎng)期從事毛細(xì)管電泳技術(shù)的生物醫(yī)藥分析新方法和應(yīng)用研究。2007年起在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20875009, 21175011, 21375008)和“973”項(xiàng)目(2007CB914101, 2012CB910603)資助下,從事小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和微生物等多尺度靶標(biāo)的核酸適配體篩選機(jī)理和方法研究近十年,建立了基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的核酸適配體篩選和研究平臺(tái)。本專(zhuān)欄發(fā)表的小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和微生物靶標(biāo)的核酸適配體篩選方法綜述,將有助于從事核酸適配體篩選研究的學(xué)者和應(yīng)用單位了解核酸適配體篩選的方法和新進(jìn)展。

本專(zhuān)欄客座主編北京理工大學(xué)教授

收稿日期:2016-03-15

DOI:10.3724/SP.J.1123.2016.03020 10.3724/SP.J.1123.2016.02003

*通訊聯(lián)系人.E-mail:hzlian@nju.edu.cn.