靈芝DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（GlMET1）基因克隆及原核表達(dá)誘導(dǎo)分析

查良平 王亞君 劉爽 趙玉洋 袁媛 黃璐琦

[摘要]DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化過程中最關(guān)鍵的酶，對生物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)起著重要作用。研究根據(jù)靈芝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過全基因合成首次克隆得到靈芝DNA甲基轉(zhuǎn)移酶GlMET1，Genbank注冊號為KU239998，并對其基因特性和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析。原核表達(dá)誘導(dǎo)分析表明pET28a（+）GlMET1重組質(zhì)粒在BL21（DE3）中能成功表達(dá)出目的蛋白，對其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出蛋白最合適的表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度為16 ℃，重組菌生長25 h（A600為08），IPTG濃度為02 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間為12 h。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明不同品種靈芝GlMET1的基因表達(dá)水平均有明顯差異，且GlMET1在成熟期的表達(dá)水平均低于幼年期，說明GlMET1表達(dá)量隨著靈芝的生長發(fā)育呈下降趨勢。該研究結(jié)果為深入研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]靈芝；甲基化；甲基轉(zhuǎn)移酶；基因克??；原核表達(dá)

表觀遺傳修飾是指不改變DNA序列的可遺傳的對堿基和組蛋白的化學(xué)修飾，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA等[1]。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，在生物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)方面起著重要作用，如參與轉(zhuǎn)座子沉默，基因印跡和X染色體失活等生物學(xué)過程。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下完成的，甲基轉(zhuǎn)移酶將SAM的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上從而完成甲基化過程[2]。DNA 甲基化反應(yīng)的催化劑DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，Dnmt） 在染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。目前在植物中至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，即甲基轉(zhuǎn)移酶l （methyltransferas，METl）、結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（domains rearranged methyltransferas，DRM）和染色質(zhì)甲基化酶（chromomethylase 3，CMT3） [35]。MET1被認(rèn)為是具有統(tǒng)治地位的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，它具有使核苷酸序列中CG堿基的胞嘧啶的甲基化的作用，同時METl能夠影響植物的形態(tài)特征、調(diào)控開花的時間等[6]。

中藥靈芝G lucidum是食藥兼用的一種真菌植物，含有多糖、萜類化合物、生物堿、核苷、氨基酸多肽和微量元素等多種活性成分，其中靈芝多糖和三萜類化合物是靈芝的主要活性成分，研究表明它們具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和降血糖等多種生物活性[79]。自20世紀(jì)80年代以來，對靈芝的分子生物學(xué)、次生代謝產(chǎn)物和藥理等均進(jìn)行了深入的研究，尤其是圍繞靈芝三萜酸生物合成相關(guān)基因的篩選、克隆和功能分析已有大量報道，轉(zhuǎn)錄組和基因組信息為研究靈芝基因組多樣性奠定了基礎(chǔ)，靈芝被認(rèn)為是研究真菌次生代謝的理想模式物種[1011]。目前已從多種植物中分離克隆出METl酶基因，如擬南芥[12]、玉米[13]、草莓[14]、馬鈴薯[15]等，但藥用植物的MET1酶基因報道較少。本研究首次從靈芝轉(zhuǎn)錄組中篩選得到靈芝DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因GlMET1，采用全基因合成克隆得到其cDNA序列，對其基因特性和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建pET28a（+）GlMET1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)換至表達(dá)菌BL21（ DE3）中，對影響蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、IPTG濃度及宿主菌吸光度等4個因素進(jìn)行了優(yōu)化，同時采用實(shí)時熒光定量PCR檢測不同品種和不同生長時期的GlMET1表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的功能及其在靈芝發(fā)育過程中的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11藥材

霍芝1號采自于安徽省六安市霍山縣衡濟(jì)堂公司，赤芝10號采自于安徽省六安市霍山縣一品堂公司，金芝1號采自于安徽省六安市金寨縣喬康藥業(yè)，野生靈芝采自于安徽省金寨縣鐵沖鄉(xiāng)。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定，樣品經(jīng)鑒定后保存于-80 ℃冰箱。

12菌株、載體和試劑

大腸桿菌BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存。原核表達(dá)載體pET28a（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA測序由北京睿博生物科技公司完成，寡核苷酸引物由上海生工生物工程公司合成。限制性內(nèi)切酶購自NEB有限公司。

13總RNA 提取及cDNA的合成

稱取100 mg左右靈芝新鮮的子實(shí)體，加液氮置于球磨機(jī)上研磨，采用CTAB法從新鮮的子實(shí)體中提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳用于評價RNA的質(zhì)量。ND2000測定總RNA的A260，A280，選擇A260/A280為18～20的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

14GlMET1全基因合成及原核表達(dá)載體構(gòu)建

靈芝DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（GlMET1）的基因來源于靈芝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。選擇整條序列的3 554個堿基作為克隆的對象，在引物的兩端各設(shè)計(jì)了BamHI和SalI酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，序列總?cè)L為3554 bp，全基因合成由江蘇蘇州泓迅生物科技有限公司完成。對帶有酶切位點(diǎn)的GlMET1和pET28a（+）載體分別進(jìn)行雙酶切，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，25 ℃連接3 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板上37 ℃。挑單克隆菌液PCR，雙酶切和測序鑒定。

15GlMET1的生物信息學(xué)分析

將測序獲得的序列結(jié)果使用ORF Finder （http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）查找開放閱讀框（ORF）。利用在線工具Protparam （http：//wwwexpasych/tools/protparamhtml）預(yù)測基因編碼蛋白的相對分子量、氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)、親水性/疏水性和編碼區(qū)全長等理化性質(zhì)；采用CDD（http：//wwwncbimlmnihgov/Structure/cdd/wrpsbcgi）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；采用CFSSP（http：//wwwbiogemorg/tool/choufasman/）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析；利用Swiss Model（http：//swissmodelexpasyorg/）程序，根據(jù)基因氨基酸序列進(jìn)行建模，預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。用DNAMAN軟件對序列進(jìn)行多重比對以及限制性酶切位點(diǎn)的預(yù)測，用ClustalW軟件與其他植物的氨基酸序列進(jìn)行比較，用MEGA 606軟件構(gòu)建Neighborjoining系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1 000次。

16pET28a（+）GlMET1的原核表達(dá)及條件優(yōu)化

將構(gòu)建好的pET28a（+）GlMET1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌。取轉(zhuǎn)化表達(dá)菌液按照1∶100加到含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 250 r·min-1振蕩培養(yǎng)約25 h至A600 04～06，加IPTG于16 ℃低溫誘導(dǎo)12 h，收集菌體，加入等體積的2×loading buffer 煮沸，上樣，用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDSPAGE分析。針對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、IPTG濃度，及IPTG添加時間（ 即誘導(dǎo)起始菌液濃度A600） 等4個因素對原核表達(dá)產(chǎn)物的積累有一定影響，分析了這4個因素對靈芝DNMT1重組蛋白表達(dá)的影響。

17Realtime PCR

從轉(zhuǎn)錄組中數(shù)據(jù)中獲取靈芝內(nèi)參照GlGPD和GlMET1的核苷酸序列，利用Primer Premier 50設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長度在100～250 bp，送由生工生物工程（上海）公司合成，其中GPD上游引物為5′CGCTCAACAAGAACTTCGTCAA3′，GPD下游引物為5′CGTAGACAAGGAGGTCACAGA3′，GlMET1上游引物為5′ATCGATCCAACGGCAAAG3′，GlMET1下游引物為5′CACAGAAGACGAACGAATCC3。反應(yīng)體系： 5 μL 2×SYBR green，02 μL ROX Reference Dye，02 μL引物1，02 μL引物2，10 μL cDNA，34 μL H2O。PCR 反應(yīng)條件為： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個擴(kuò)增循環(huán)；dissociation stage。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量，結(jié)束后分析熔解曲線。各基因表達(dá)量以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對定量，每個反應(yīng)重復(fù)3次，相對定量方法采用2-ΔCT法分析結(jié)果。

2結(jié)果

21GlMET1基因的全基因合成及生物信息學(xué)分析

依據(jù)靈芝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得靈芝GlMET1的cDNA，利用DNAMAN軟件結(jié)合ORF Finder在線軟件對GlMET1基因全長cDNA 序列進(jìn)行分析， 預(yù)測其含3 554 bp完整的開放閱讀框，通過全基因合成技術(shù)完成GlMET1的克隆，其測序結(jié)果與預(yù)測結(jié)果相一致。NCBI BLASTX 顯示GlMET1與污叉絲孔菌Dichomitus squalens 65%相似，云芝Trametes versicolor 46%相似，粉孢革菌Coniophoraputeana 42%相似。比對表明所獲基因?qū)儆贛ET1家族，將該基因命名為GlMET1，GenBank注冊號為KU239998。

利用NCBI的 Conserved domains在線工具分析GlMET1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明GlMET1具有4個功能域：39～166 aa的肽端與DNMT1RFD super family有較高的同源性，365～496 aa與39～637 aa均為保守的BAH結(jié)構(gòu)域，700～1 160 aa與Dcm家族有較高的同源性。利用在線生物學(xué)工具TMHMM20 Server對進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，結(jié)果顯示無跨膜區(qū)。使用ExPASy在線服務(wù)器的SWISSMODEL Homology Modeling對GlMET1蛋白進(jìn)行同源建模，得到了蛋白的三維空間模型，GlMET1蛋白模型4yoc1A得分為062，蛋白序列的相似性為2599%，見圖1。

22GlMET1序列家族同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將GlMET1與GenBank中20種其他植物的同源蛋白進(jìn)行比對， 在軟件MEGA 606平臺上采用相鄰連接法構(gòu)建進(jìn)化樹， 進(jìn)行聚類關(guān)系分析，見圖2。從進(jìn)化樹中，可以得知不同類植物在進(jìn)化樹中分別聚成不同的分支，雙子葉植物的GlMET1聚為一個分支，進(jìn)而與單子葉植物的MET1聚為一個大的分支，與GlMET1親緣關(guān)系最近的為真菌植物Termitornyces sp和Moniliophthora roreri， 藻類植物的MET1與所有植物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

23pET28a（+）GlMET1原核誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的pET28a（+）GlMET1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21（ DE3） 中，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，所得菌體經(jīng)離心煮沸后進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳分析，見圖3。結(jié)果表明在149 kDa處出現(xiàn)目的蛋白條帶，GlMET1基因的cDNA由3 545個堿基組成，編碼133 kDa蛋白，原核表達(dá)載體pET28a上的HisTag標(biāo)簽大小為16 kDa，所以重組表達(dá)載體編碼蛋白大約為149 kDa； 而陰性對照E coli[pET28a]誘導(dǎo)表達(dá)后在149 kDa處沒有條帶出現(xiàn)，表明含有GlMET1基因的重組質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)。

At擬南芥Arabidopsis thaliana （NP_1997271）；At節(jié)節(jié)麥Aegilops tauschii（EMT234551）；Ca鷹嘴豆Cicer arietinum；Ci野菊花Chrysanthemum indicum；Cs亞麻薺Camelina sativa；Gs大豆Glycine soja；Mn川桑Morus notabilis；Mt蒺藜苜蓿Medica gotruncatula；Mr Moniliophthora roreri；Nt煙草Nicotiana tabacum；Os水稻Oryza sativa Japonica Group；Ot 綠藻Ostreococcus tauri；Pt毛果楊Populus trichocarpa； Pp巴旦木Prunus persica； Pp小立碗蘚Physcomitrella patens；Sl番茄Solanum lycopersicum； Si小米Setaria italica； Tc可可Theobroma cacao；Vv葡萄Vitis vinifera；TsTermitornyces sp。

24pET28a（+）GlMET1表達(dá)條件的優(yōu)化

241誘導(dǎo)溫度對pET28a（+）GlMET1蛋白表達(dá)的影響保持誘導(dǎo)時間12 h， IPTG濃度為04 mmol·L-1， A600為06不變，觀察不同誘導(dǎo)溫度16，20，25，30，37 ℃對pET28a（+）GlMET1蛋白表達(dá)的影響，見圖4。溫度為16，20 ℃時，pET28a（+）GlMET1有表達(dá)，且誘導(dǎo)溫度為16 ℃時的表達(dá)量更高，但隨著溫度繼續(xù)上升，pET28a（+）

M蛋白質(zhì)Marker； C： Escherichia coli[pET28a]；1未誘導(dǎo)的E coli[pET28a（+）GlMET1]； 2誘導(dǎo)后的E coli[pET28a（+）GlMET1]。

GlMET1在25，30，37 ℃均未產(chǎn)生表達(dá)，表明該蛋白適合低溫誘導(dǎo)，最合適溫度為16 ℃。

M.蛋白質(zhì)Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；15E coli[pET28a（+）GlMET1]，誘導(dǎo)溫度分別為16，20，25，30，37 ℃。

242誘導(dǎo)時間對pET28a（+）GlMET1蛋白表達(dá)的影響保持誘導(dǎo)溫度16 ℃，IPTG濃度為04 mmol·L-1，A600為06不變，觀察不同誘導(dǎo)時間2，4，8，12，24 h對pET28a（+）GlMET1蛋白表達(dá)的影響，見圖5。隨著誘導(dǎo)時間增加，pET28a（+）GlMET1表達(dá)呈增加趨勢，在誘導(dǎo)時間為12 h時其表達(dá)量最高，說明誘導(dǎo)時間有利于目的蛋白的表達(dá)。

M.蛋白Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；1～5E coli[pET28a（+）GlMET1]，誘導(dǎo)時間分別為2，4，8，12，24 h。

243IPTG濃度對pET28a（+）GlMET1蛋白表達(dá)的影響保持誘導(dǎo)溫度16 ℃，誘導(dǎo)時間12 h，A600為06不變，觀察不同IPTG濃度0，01，02，04，06，08，10 mmol·L-1對pET28a（+）GlMET1蛋白表達(dá)的影響，見圖6。隨著IPTG濃度增加，pET28a（+）GlMET1表達(dá)沒有明顯變化，說明高濃度的IPTG不能增加目的蛋白的表達(dá)，低濃度的IPTG反而有利于目的蛋白的表達(dá)。

M蛋白Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；1～7E coli[pET28a（+）GlMET1]，IPTG濃度分別為0，01，02，04，06，08，10 mmol·L-1。

圖6pET28a（+）GlMET1在不同IPTG濃度處理下的表達(dá)

Fig6Expression of pET28a（+）GlMET1 protein at different IPTG concentration

244宿主菌吸光度A600對pET28a（+）GlMET1蛋白表達(dá)的影響保持誘導(dǎo)溫度16 ℃，誘導(dǎo)時間12 h， IPTG濃度為04 mmol·L-1不變，選擇誘導(dǎo)時宿主菌的吸光度（A600）分別為02，04，06，08和1時，觀察pET28a（+）GlMET1蛋白的表達(dá)，見圖7。隨著宿主菌的吸光度（A600）增加，pET28a（+）GlMET1表達(dá)先上升后下降，在A600為08的時候目的蛋白的表達(dá)最高。

M蛋白Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；1～5 E coli[pET28a（+）GlMET1]，宿主菌的吸光度（A600）分別為02，04，06，08，1。

圖7pET28a（+）GlMET1在不同宿主菌密度下的表達(dá)

Fig7Expression of pET28a（+）GlMET1 protein in different culture densities before IPTG induction

25靈芝GlMET1的基因表達(dá)水平分析

為進(jìn)一步了解靈芝甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)模式，本研究通過Realtime PCR技術(shù)對安徽大別山區(qū)靈芝的3個栽培品種和1個野生品種進(jìn)行了表達(dá)差異分析，見圖8。結(jié)果顯示GlMET1在不同品種靈芝中的表達(dá)水平有明顯差異，且在不同生長時期也有差異。一方面，GlMET1在不同品種間的表達(dá)量依次為野生靈芝>霍芝1號>金芝1號>赤芝10號；另一方面，不同發(fā)育時期的GlMET1表達(dá)水平在4個品種中均表現(xiàn)出成熟期低于幼年期，說明GlMET1表達(dá)量隨著靈芝的生長發(fā)育呈下降趨勢。

3討論

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在植物和真菌的生長發(fā)育過程中具有重要的表觀遺傳調(diào)控作用，被認(rèn)為是表觀遺傳中最關(guān)鍵酶之一。本研究首次通過靈芝轉(zhuǎn)錄組克隆得到靈芝DNA甲基轉(zhuǎn)移酶GlMET1，并利用生物信息學(xué)的方法對其核酸及其推測的蛋白序列組成進(jìn)行分析，對構(gòu)建的pET28a（+）GlMET1重組質(zhì)粒進(jìn)行了原核表達(dá)蛋白優(yōu)化分析，同時分析了不同生長時期及不同品種靈芝GlMET1的基因表達(dá)水平，

為深入研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本研究將GlMET1基因與原核表達(dá)載體pET28a（+）構(gòu)建了融合表達(dá)載體，并成功地在大腸桿菌BL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，對影響蛋白表達(dá)的四大因素誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、IPTG濃度及誘導(dǎo)起始菌液濃度A600進(jìn)行了優(yōu)化分析，確定了pET28a（+）GlMET1蛋白最合適的表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度為16 ℃條件下，重組菌生長25 h（A600為08）時，IPTG濃度為02 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間為12 h時，蛋白的表達(dá)量最高。這為后續(xù)研究GlMET1的蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

在植物中第1個克隆的編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因MET1是在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，多項(xiàng)研究表明MET1的功能主要是維持DNA序列上的CG甲基化。擬南芥中MET1家族有4個成員，即METl，MET2a，MET2b以及MET3，且不同基因轉(zhuǎn)錄水平有較大不同，METl基因只在分生組織中轉(zhuǎn)錄，而MET2a，MET2b這2個基因的轉(zhuǎn)錄能夠發(fā)生在所有組織中[12，16]。研究表明MET1類基因的在植物的特定器官中表達(dá)易受環(huán)境脅迫的影響，玉米不同組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因（ZmMET1） 的轉(zhuǎn)錄水平在冷脅迫條件下差異很大， 其中該基因在中胚軸中轉(zhuǎn)錄水平比較高， 而在根中幾乎不表達(dá)[13]。本研究對不同品種和不同生長時期的靈芝MET1表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GlMET1在不同品種靈芝中的表達(dá)水平有明顯差異，且在幼年時期的表達(dá)水平均高于成熟時期，這暗示在靈芝的生長發(fā)育過程中MET1基因可能發(fā)揮著調(diào)控作用，具體調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

[致謝]在靈芝樣品收集過程中，得到安徽霍山衡濟(jì)堂公司、安徽霍山一品堂公司和安徽金寨喬康藥業(yè)的幫助。

[參考文獻(xiàn)]

[1]史玉杰， 李慶賀， 劉曉輝 DNA 甲基化與基因表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展[J] 中國生物工程雜志， 2013（7）：17.

[2]Chan S W， Henderson I R， Jacobsen S E Gardening the genome： DNA methylation in Arabidopsis thaliana [J] Nat Rev Genet， 2005，6（5）：351

[3]Martienssen R A， Colot V DNA methylation and epigenetic inheritance in plants and filamentous fungi[J] Science， 2001， 293（5532）： 1070

[4]Jeltsch A Beyond Watson and Crick： DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases[J] Chem Bio Chem， 2002， 3（4）： 274

[5]Finnegan E J， Kovac K A Plant DNA methyltransferases[J] Plant Mol Biol， 2000， 43（2/3）： 189

[6]Finnegan E J， Peacock W J， Dennis E S DNA methylation， a key regulator of plant development and other processes[J] Curr Opin Genet Dev， 2000， 10（2）： 217

[7]Liu W， Wang H， Pang X， et al Characterization and antioxidant activity of two lowmolecularweight polysaccharides purified from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum[J]. Int J Biol Macromol， 2010， 46（4）： 451

[8]Liu Z， Xing J， Huang Y， et al Activation effect of Ganoderma lucidum polysaccharides liposomes on murine peritoneal macrophages[J] Int J Biol Macromol， 2016，82：973

[9]Cheng S， Sliva D Ganoderma lucidum for cancer treatment we are close but still Not there[J] Integr Cancer Ther， 2015， 14（3）： 249

[10]Mu D S， Li C， Shi L， et al Bioinformatic identification of potential MicroRNAs and their targets in the lingzhi or reishi medicinal mushroom Ganoderma lucidum （Higher Basidiomycetes）[J]. Int J Med Mushrooms， 2015， 17（8）：783

[11]Xu Z， Xu J， Ji A， et al Genomewide selection of superior reference genes for expression studies in Ganoderma lucidum[J] Gene， 2015， 574（2）： 352

[12]Chan S W L， Henderson I R， Jacobsen S E Gardening the genome： DNA methylation in Arabidopsis thaliana[J] Nat Rev Genet， 2005， 6（5）： 351

[13]Steward N， Kusano T， Sano H Expression of ZmMET1， a gene encoding a DNA methyltransferase from maize， is associated not only with DNA replication in actively proliferating cells， but also with altered DNA methylation status in coldstressed quiescent cells[J] Nucleic Acids Res， 2000， 28（17）： 3250

[14]常琳琳， 張志宏， 張運(yùn)濤， 等 草莓 MET1 基因啟動子克隆及瞬時表達(dá)分析[J] 西北植物學(xué)報， 2011， 31（6）： 1110

[15]毛銳濤 馬鈴薯甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶預(yù)測及表達(dá)研究[D]呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)， 2014

[16]Kishimoto N， Sakai H， Jackson J， et al Site specificity of the Arabidopsis METI DNA methyltransferase demonstrated through hypermethylation of the superman locus[J] Plant Mol Biol， 2001， 46（2）： 171

[責(zé)任編輯呂冬梅]