鷹嘴豆水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

趙堂彥，孟茜，王琴，張奇波，陳霞，黃玉軍，陳大衛(wèi)，顧瑞霞，*（.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州57；.新疆克拉瑪依農(nóng)牧業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，新疆克拉瑪依834000）

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鷹嘴豆水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

趙堂彥1，孟茜1，王琴2，張奇波2，陳霞2，黃玉軍2，陳大衛(wèi)2，顧瑞霞1，*
（1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225127；2.新疆克拉瑪依農(nóng)牧業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，新疆克拉瑪依834000）

摘要：研究鷹嘴豆水提物的不同組分對(duì)a-糖苷酶的抑制作用，其對(duì)a-糖苷酶的半抑制濃度為0.20 mg/mL。將鷹嘴豆水提物經(jīng)過大孔樹脂D101篩選，對(duì)其不同組分進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆水提物經(jīng)過不同乙醇濃度洗脫，其對(duì)α-糖苷酶的抑制效果逐漸增強(qiáng)，其中40 %乙醇組分對(duì)α-糖苷酶的抑制效果最強(qiáng)。同時(shí)應(yīng)用LC-MS定性分析組分，發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆水提物中可能存在鷹嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb、芒柄花素等物質(zhì)。說明這些皂苷及異黃酮類化合物影響α-葡萄糖苷酶抑制效果。

關(guān)鍵詞：鷹嘴豆；α-葡萄糖苷酶；降糖

鷹嘴豆，學(xué)名Cicer aretinum L.，豆科鷹嘴豆屬。目前我國鷹嘴豆的主要產(chǎn)地在新疆烏什、木壘等地[1]。中醫(yī)藥認(rèn)為鷹嘴豆性味甘、平、無毒，有補(bǔ)中益氣、溫腎壯陽、主消渴、解血毒、潤肺止咳等功效，具有很高的保健和藥用價(jià)值[1]。近年來鷹嘴豆的食藥用價(jià)值也逐漸被人們所重視。王玉芹[2]等研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆粉具有一定的降血糖作用，其70 %乙醇提取物和水提物降糖作用明顯。李燕[3]等研究結(jié)果顯示鷹嘴豆皂苷和異黃酮對(duì)糖尿病小鼠確有降低血糖和調(diào)節(jié)血脂的功能。綜合國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆資源具有降血糖、降血壓、降血膽固醇、抗腫瘤、抗氧化、利尿等多種功能，其中活性成分包括大豆異黃酮、皂苷、糖類等。

α-葡萄糖苷酶存在于人體小腸腔內(nèi)，包括α-淀粉酶、小腸刷狀緣的麥芽糖酶、α-糊精酶和蔗糖酶等。人體在正常攝入碳水化合物后經(jīng)過酶分解成葡萄糖、果糖、半乳糖等，經(jīng)腸壁細(xì)胞吸收而后被人體利用。糖尿病患者因?yàn)榇x障礙而導(dǎo)致血糖濃度發(fā)生異常變化。預(yù)防和治療這類疾病的一種有效方法就是限制或延緩多糖的分解，所以必須降低α-葡萄糖苷酶活性[4]。而α-葡萄糖苷酶抑制劑能夠降低α-葡萄糖苷酶的活性，從而降低多糖的分解速度，有效降低餐后高血糖，如今已作為治療Ⅱ型糖尿病的有效藥物類型。

許多研究認(rèn)為鷹嘴豆具有降糖功效，然而其降血糖功能成分并不十分清晰。本文將鷹嘴豆水提物通過大孔樹脂分離，對(duì)不同組分的α-葡萄糖苷酶的抑制效果進(jìn)行比較，探討鷹嘴豆中具有的降糖活性成分，為開發(fā)利用鷹嘴豆資源提供技術(shù)支持。

1　儀器與試劑

鷹嘴豆：購自新疆；鷹嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb（分析標(biāo)準(zhǔn)品）：購自阿拉丁公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力：30 000 U/g）；對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：購自Sigma公司；其他試驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。

全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo Electron公司；TU—1800型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司；6460液質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫科技公司。

2　方法

2.1鷹嘴豆水提物制備

取鷹嘴豆粉100 g加入2 500 mL水中經(jīng)充分混合后、加熱到70℃，浸提2 h，期間每隔10min攪拌1次，過濾離心，取上清液（相當(dāng)于原材料濃度為

其中：a為含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含樣品的測定吸光值；b為不含α-葡萄糖苷酶溶液及待測樣品的測定吸光值；c為含有α-葡萄糖苷酶溶液及待測樣品的測定吸光值；d為不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待測樣品的測定吸光值。

2.4大孔樹脂組分的液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜：色譜柱C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫度保持在30℃，進(jìn)樣量為20 μL。流動(dòng)相：A（甲醇）和B（0.1 %甲酸水，體積比），使用梯度洗脫如下：0～4.5min，45 %A～70 %A；4.5min～4.6min，70 %A～95 %A；4.6min～10.0min，95 %A；再快速返回初始比例A-B （45：55，體積比），后運(yùn)行時(shí)間6min。液相流量設(shè)定為1.0 mL/min。檢測波長：260 nm。

質(zhì)譜：電噴霧ESI，正負(fù)離子模式；霧化氣：N2；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣體溫度：350℃。

2.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用spss軟件進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）。40.00 mg/mL）稀釋成1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.01 mg/mL備用，以阿卡波糖為對(duì)照組。

2.2鷹嘴豆水提物大孔樹脂組分分離

鷹嘴豆水液分散于適量的去離子水，反復(fù)用D101型大孔吸附樹脂（8 cm×100 cm）進(jìn)行吸附處理，接液流速為8 mL/min。待穿透液（未被吸附）流份于真空泵旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃濃縮并于60℃恒溫干燥箱烘干成浸膏，得到58.9 g穿透部位組分（名為Fr.l），接著用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（0、20 %、40 %、60 %、80 %、100 %）梯度洗脫被吸附的組分，同樣方法得到各部位浸膏并分別名為Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6和Fr.7，并凍干成粉末備用。

2.3α-葡萄糖苷酶抑制劑活性測定

α-葡萄糖苷酶抑制劑活性測定參照李明娟等[5]的方法，在600 μL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）中分別加入200 μL α-葡萄糖苷酶溶（0.2U/mL）和100 μL不同組分的待測樣品；將混合物于37℃水浴10min，再加入200 μL 20 mmol/L PNPG溶液，繼續(xù)反應(yīng)5min；加入1 mL 1 mol/L Na2CO3作為反應(yīng)終止液，于405 nm處測其吸光值，計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率。

3　結(jié)果與分析

3.1鷹嘴豆水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

鷹嘴豆水提物經(jīng)過濾離心后，稀釋成不同濃度，檢測其α-糖苷酶的抑制活性，以阿卡波糖為對(duì)照。如圖1所示。

圖1　鷹嘴豆水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用影響Fig.1 Effect of chickpea water extract on inhibition rate of αglucosidase

從圖中可以看出，作用在0～0.1 mg/mL范圍內(nèi)，隨濃度增加其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率隨之增加。鷹嘴豆水提物濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，其濃度與抑制率呈線性相關(guān)，其回歸方程為y=0.3175x+0.4127，R2= 0.969 7，求其IC50是0.28mg/mL。在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，其濃度與抑制率呈線性相關(guān)，y = 0.277 8x + 0.444 4，R2= 0.997 6，其IC50為0.20 mg/mL。同時(shí)鷹嘴豆水提物與阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)了幾乎平行的抑制曲線。總體上鷹嘴豆水提物具有較好的酶抑制活性。

3.2鷹嘴豆水提物各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

鷹嘴豆水提物大孔樹脂不同洗脫組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用見表1，從100 g干燥鷹嘴豆粉中提取得到了5 312.50 mg的水提物干粉，總干粉對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為40.20 %，并且計(jì)算得其抑制活力為427.13單位。

表1　大孔樹脂洗脫部位對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Table 1 Inhibition rate of constituents to α-glucosidase and of counts

與未洗脫前的樣品相比，未吸附的樣品組分Fr1抑制率明顯下降，說明其活性物質(zhì)已被大孔樹脂吸附。Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別與鷹嘴豆水提物中經(jīng)過0 %、20 %、40 %、60 %、80 %、100 %乙醇洗脫后的組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率對(duì)應(yīng)。經(jīng)過不同濃度的乙醇洗脫后其抑制率都有所增加，洗脫的組分中，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最大的組分為Fr4，其次為Fr3，抑制率最低的為Fr7，說明其活性物質(zhì)已基本洗脫完全。

同時(shí)未被吸附的提取物Fr1的總活力比未洗脫前的樣品下降了25.91 %，且大孔樹脂吸附的總活力為110.69單位。在洗脫的組分中，總活力單位最大的組分為Fr2，其次為Fr3，總活力最低的為Fr7，隨著不同濃度的洗脫，組分質(zhì)量逐漸下降，總活力也逐漸下降，說明其活性成分被逐漸洗脫。同時(shí)大孔樹脂吸附鷹嘴豆水提物為929.70 mg，其中未被洗脫存留柱子中質(zhì)量為195.50 mg，占總量的9.20 %（減少部分可能為色素或雜質(zhì)）。其中Fr.2-7相加的總活力為79.31單位（18.57%），比吸附的總活力減少了31.38單位（7.3 %）。

圖2　Fr1組分在電噴霧負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖Fig.2 ESI（-）-MS of compound Fr1

圖3　Fr2組分在電噴霧正離子模式下的質(zhì)譜圖Fig.3 ESI（+）-MS of compound Fr2

圖4　Fr3組分在電噴霧正離子模式下的質(zhì)譜圖Fig.4 ESI（+）-MS of compound Fr3

3.3應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)大孔樹脂活性組分定性分析

Fr1組分最大吸收波長為262 nm，在保留時(shí)間9.585min～9.762min時(shí)，ESI-MS m/z：313.2[M+Na+3H]+，855.1 [2M +3H]+，447.4 [M-H]-，491.3 [M +CH2O2-H]-，894.5[2M+2H]-，958.7[M+OH]+981.3[M+Na+OH]+…比對(duì)平均相對(duì)分子質(zhì)量以及保留時(shí)間，結(jié)合文獻(xiàn)[6-10]推測Fr1組分中可能存在鷹嘴豆芽素A-7-O-β-D-葡萄糖苷、鷹嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb等物質(zhì)。

圖5　Fr4組分在電噴霧負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖Fig.5 ESI（-）-MS of compound Fr4

Fr2組分最大吸收波長為256nm，在保留時(shí)間9.740min～9.917min時(shí)，ESI-MS m/z：267.3 [M+H]+，292.6[M+Na+H]+，534.6[2M+2H]+，428.4[M+H]+，834.2 [2M-Na+H]+，855.2 [2M+H]+…比對(duì)平均相對(duì)分子質(zhì)量以及保留時(shí)間，結(jié)合文獻(xiàn)[6-10]推測Fr2組分中可能存在芒柄花素、β-香樹脂醇等物質(zhì)。

Fr3組分最大吸收波長為257nm，在保留時(shí)間9.075min～9.164min時(shí)，ESI-MS m/z：477.3 [M+3H]+，441.1[M-K+3H]+，883.2[2M+H]+，859.5[2M-Na-2H]+，939.7[M+3H]+，906.3[2M-K+3H]+…比對(duì)平均相對(duì)分子質(zhì)量以及保留時(shí)間，結(jié)合文獻(xiàn)[6-11]推測Fr3組分中可能存在大豆精醇A、大豆皂苷Bb等物質(zhì)。

Fr4組分最大吸收波長為310 nm，在保留時(shí)間7.701min～7.790min時(shí)，ESI-MS m/z：979.5[M+K-2H]+，980.5[M+K-H]+，981.4[M+K]+…比對(duì)平均相對(duì)分子質(zhì)量以及保留時(shí)間，結(jié)合文獻(xiàn)[6-10]推測Fr4組分中可能存在大豆皂苷Bb等物質(zhì)。

4　討論

本文采用體外α-葡萄糖苷酶體外抑制模型對(duì)鷹嘴豆水提物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶有較高的抑制作用，隨著濃度的升高其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率也隨之增大，當(dāng)水提物濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL范圍內(nèi)其濃度與抑制率呈線性相關(guān)，其回歸方程為y = 0.317 5x + 0.412 7，R2= 0.969 7，求其IC50是0.28 mg/mL。在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，其濃度與抑制率呈線性相關(guān)，y = 0.277 8x + 0.444 4，R2= 0.997 6，其IC50為0.20 mg/mL。其陽性對(duì)照阿卡波糖IC50為0.02 mg/mL。說明在低濃度時(shí)鷹嘴豆對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性具有劑量依賴性。

本文中鷹嘴豆水提物經(jīng)過大孔樹脂D101篩選獲得6個(gè)組分。不同組分對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有較高的抑制活性，而且經(jīng)過洗脫后其抑制效果均高于鷹嘴豆水提物。但不同組分提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果有差異。隨著洗脫濃度的增加，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果呈現(xiàn)增加的趨勢，抑制率最大的組分為Fr4，達(dá)到60.6 %，其次為Fr3，抑制率最低的為Fr7，可能是因?yàn)樵谝掖枷疵撨^程中有效成分已洗脫，同時(shí)α-葡萄糖苷酶抑制活性不僅與濃度有關(guān)，還與提取物成分密切相關(guān)。在不同洗脫組分中Fr2總活力最多，達(dá)4.64 %，其次為Fr3，總活力最低的為Fr7。同時(shí)應(yīng)用LC-MS定性分析鷹嘴豆水提物，發(fā)現(xiàn)Fr1組分中可能存在鷹嘴豆芽素A-7-O-β-D-葡萄糖苷、鷹嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb等物質(zhì)；Fr2組分中可能存在芒柄花素、β-香樹脂醇等物質(zhì)；Fr3組分中可能存在大豆精醇A、大豆皂苷Bb等物質(zhì)；Fr4組分中含有大豆皂苷Bb等物質(zhì)，由于提取物中雜質(zhì)較多，沒有純化，確定成分需進(jìn)一步研究。結(jié)果說明鷹嘴豆水提物中含有皂苷及異黃酮類化合物，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果明顯。同時(shí)這些活性成分可能具有協(xié)同作用或者存在新結(jié)構(gòu)類群，可以通過拼合原理，增加化合物的成藥性，為開發(fā)降糖新藥奠定基礎(chǔ)。

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Study on the Inhibiting Effects of the Aqueous Extract from Chickpeas on the α-Glucosidase

ZHAO Tang-yan1，MENG Qian1，WANG Qin2，ZHANG Qi-bo2，CHEN Xia2，HUANG Yu-jun2，CHEN Da-wei2，GU Rui-xia1，*
（1.Jiangsu Province Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2.Xinjiang Karamay Agriculture Science and Technology Research Institute，Kelamayi 834000，Xinjiang，China）

Abstract：This paper reports the α-glucosidase inhibition of the aqueous extract from different chickpea components is determined.It is found that its half-inhibitory concentration（IC50）to the enzymic activity of α- glycosidase is 0.20 mg/mL.The chickpea aqueous extracts are screened by macroporous resin D101 for evaluation of activity of the different components in it.The results show that through the elution by ethanol of different concentrations，chickpeas aqueous extract shows stronger inhibition effect on α-glycosidase gradually，components with the 40 % ethanol exhibits the strongest inhibitory effect.At the same time, it is determined by LC-MS chromatograms that the different components in the chickpeas aqueous extract may consist of the Biochanin A、Soyasaponin Bb、Formononetin etc，which illustrate that these saponin and isoflavone compounds influence the inhibition effect from α-glycosidase.

Key words：chickpea；α-glucosidase；hypoglycemic

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.002

基金項(xiàng)目：江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYLX_1348）；江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2011383）；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（12KJA550003）

作者簡介：趙堂彥（1990—），男（漢），碩士研究生，研究方向：乳品科學(xué)。

*通信作者：顧瑞霞（1963—），男（漢），教授，博士，研究方向：乳品科學(xué)。

收稿日期：2015-10-30