煙熏誘導慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的建立及驗證

張?zhí)m英，張婧，歐陽瑤

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

煙熏誘導慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的建立及驗證

張?zhí)m英，張婧，歐陽瑤

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

目的 建立一種煙熏誘導的慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠模型，并對其進行驗證。方法 將32只C57BL/6小鼠隨機分為正常組、煙熏2周組、煙熏4周組、恢復組，各8只。正常組不予煙熏，煙熏2、4周組及恢復組置于熏煙箱中，被動吸煙6支/次，每次1 h；兩次間隔30 min呼吸新鮮空氣，4次/d，5 d/周。煙熏2周組第10天停止吸煙，煙熏4周組第26天停止吸煙，恢復組煙熏4周后再正常飼養(yǎng)2周。觀察各組一般情況及體質(zhì)量變化，測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量；取肺組織制備切片，HE染色觀察病理形態(tài)變化及肺泡直徑。結(jié)果 建模開始后正常組體質(zhì)量呈上升趨勢，煙熏2、4周組及恢復組出現(xiàn)精神萎靡、食欲降低，體質(zhì)量較同時間點正常組降低(P均<0.01)；恢復組停止煙熏后體質(zhì)量緩慢上升，但仍低于正常組(P均<0.05)。BALF蛋白含量：煙熏2、4周組及恢復組均明顯高于正常組(P均<0.01)；煙熏4周組及恢復組明顯高于煙熏2周組，恢復組明顯低于煙熏4周組(P均<0.01)。肺組織病理形態(tài)學顯示，正常組肺組織有少量淋巴細胞，肺泡結(jié)構(gòu)完整；煙熏2周組有少量中性粒細胞、大量單核細胞及淋巴細胞浸潤，肺泡擴大，部分肺泡間隔斷裂并融合；煙熏4周組肺組織伴有少量中性粒細胞浸潤，單核細胞及淋巴細胞浸潤較煙熏2周組明顯增多；支氣管上皮細胞變性、壞死脫落，部分肺泡間隔變窄、斷裂并融合成肺大皰。肺泡直徑：煙熏2、4周組及恢復組均大于正常組，煙熏4周組及恢復組均大于煙熏2周組(P均<0.01)，煙熏4周組與恢復組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 單純煙熏4周法成功制備COPD小鼠模型；該模型符合人類COPD的病理和功能改變，是進行COPD動物實驗的理想建模方法。

慢性阻塞性肺疾??；煙熏法；動物模型；小鼠

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限呈進行性發(fā)展且不完全可逆為特征的慢性肺疾病，與肺組織對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應有關(guān)[1]。COPD是一個高發(fā)病率、高病死率的慢性疾病，其發(fā)病率仍然在不斷上升。目前COPD的發(fā)病機制仍未明確，臨床上尚無有效的預防和治療方法[2]。理想的COPD動物模型對于其基礎和臨床研究至關(guān)重要。COPD的建模方法較多，但目前尚無公認的最理想方法。2015年4～6月，本研究采用煙熏法制備COPD小鼠模型并進行了驗證，旨在為COPD的基礎和臨床研究提供新的動物模型。

1 材料及方法

1.1 材料 動物：SPF級C57BL/6小鼠32只，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量(23±4)g，購自重慶第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心[許可證號：SCXK(渝)2012-0005] 。試劑：黃果樹牌香煙(貴州中國工業(yè)有限責任公司)，焦油量11 mg、煙氣煙堿量1.0 mg、煙氣一氧化碳量13 mg；考馬斯亮蘭(南京建成生物工程研究所)。儀器與設備：熏煙箱(自制有機玻璃箱，90 cm×40 cm×30 cm，蓋子左中右各有3個直徑為1.5 cm的通氣孔)，電子天平(上?；ǔ彪娖饔邢薰?，離心機(LD5-2A，北京京立離心機有限公司)，全自動組織切片機(RM2145，德國Leica公司 )，深低溫冰箱(MDF-382E型，日本Sanyo公司)，光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 COPD模型制備 將32只小鼠隨機分為正常組、煙熏2周組、煙熏4周組及恢復組，各8只，四組的飼養(yǎng)環(huán)境完全相同。正常組不予煙熏，煙熏2、4周組及恢復組全身置于熏煙箱中，被動吸煙6支/次，1 h/次，4次/d，時間點分別為09:00、10:30、15:00、16:30，5 d/周。熏煙2周組第12天停止吸煙，熏煙4周組第26天停止吸煙，恢復組煙熏4周后再繼續(xù)正常飼養(yǎng)2周。每次煙熏結(jié)束后，將正常組、熏煙2周組、熏煙4周組及恢復組共同置于正常的環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度21～26 ℃，濕度30%～70%，12 h明暗交替，自由攝食、攝水。

1.3 相關(guān)指標觀察 ①一般情況及體質(zhì)量：觀察各組一般情況，煙熏前及煙熏后每周稱量各組體質(zhì)量，動態(tài)觀察熏煙對小鼠體質(zhì)量的影響。②BALF蛋白含量：采用考馬斯亮藍法。最后一次煙熏后24 h，予4%水合氯醛(100 g/mL)腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠仰臥位固定于固定板上。切開氣管前方皮膚，鈍性分離暴露氣管，剖開胸腔，結(jié)扎右主支氣管，在氣管處作一倒“V”字形小口。以拔除針芯的24號靜脈套管針快速插入氣管，予生理鹽水灌洗左主支氣管和肺泡(0.6 mL/次，連續(xù)3次)。共收集BALF約1.5 mL，1 500 r/min離心10 min。取上清液，采用考馬斯亮藍法檢測BALF蛋白含量，嚴格按試劑盒說明操作。③肺組織大體形態(tài)：收集BALF后取出肺組織，觀察其大體形態(tài)。④肺組織病理形態(tài)及肺泡直徑：將右下肺組織置于10%中性緩沖甲醛固定液中進行固定，石蠟包埋、切片，行HE染色。光學顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)，每張切片隨機計數(shù)20個肺泡，測量其直徑，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況及體質(zhì)量比較 正常組直至實驗結(jié)束均無異常，毛發(fā)光澤，眼睛有神，活潑好動，食欲正常，呼吸平穩(wěn)。煙熏2、4周組逐漸出現(xiàn)體型減小，毛發(fā)枯燥，眼睛無神，精神萎靡，活動減少，食欲下降，弓背卷縮，出現(xiàn)倦怠、打噴嚏，呼吸急促。正常組無死亡，煙熏2周組熏煙過程中死亡1只。煙熏前各組體質(zhì)量比較無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，煙熏開始后正常組體質(zhì)量呈上升趨勢，而煙熏2、4周組及恢復組煙熏后體質(zhì)量較正常組同時間點降低(P均<0.01)，恢復組正常飼養(yǎng)后體質(zhì)量緩慢上升，但仍較正常組低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點體質(zhì)量比較±s)

注：與正常組同時間點比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.2 各組BALF蛋白含量比較 煙熏2、4周組及恢復組BALF蛋白含量分別為(218.41±23.85)、(539.08±184.75)、(436.19±32.96)mg/L，均高于正常組(85.64±27.88)mg/L(P均<0.01)；煙熏4周組及恢復組BALF蛋白含量均高于煙熏2周組，恢復組低于煙熏4周組(P均<0.01)。

2.3 各組肺組織大體形態(tài)比較 正常組肺組織大小正常，顏色粉紅，有光澤，無腫脹、出血。與正常組相比，煙熏2、4周組肺組織體積增大，腫脹明顯，無出血及滲出物，顏色灰白，光澤度差，肺表面有褐色斑點；且煙熏4周組較煙熏2周組更明顯。恢復組與煙熏4周組肺組織大體形態(tài)比較無明顯差異。

2.4 各組肺組織病理形態(tài)比較 正常組光鏡下肺泡間隔見少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，肺泡壁完好，肺泡結(jié)構(gòu)連續(xù)。煙熏2周組鏡下見毛細血管擴張充血、出血，局部肺泡間隔水腫增寬，伴有少量中性粒細胞及大量單核細胞、淋巴細胞浸潤，肺泡擴大，部分肺泡間隔斷裂并融合。煙熏4周組鏡下見毛細血管擴張充血、出血較多，部分肺泡腔中有紅細胞；肺間質(zhì)水腫，滲出少量水腫液，肺間隔水腫增寬；伴有少量中性粒細胞浸潤，單核細胞及淋巴細胞浸潤較煙熏2周組明顯增多；支氣管上皮細胞變性、壞死脫落，部分肺泡間隔變窄、斷裂并融合成肺大皰?；謴徒M鏡下肺泡間隔水腫較煙熏4周組明顯減輕，但局部仍有水腫，伴有少量單核細胞及淋巴細胞浸潤，較煙熏4周組減少，肺泡腔擴大與煙熏4周組無明顯差異。見插頁Ⅱ圖4。

2.5 各組肺泡直徑比較 正常組、煙熏2周組、煙熏4周組及恢復組肺泡直徑分別為(3.06±1.26)×10-2、(6.45±1.01)×10-2、(8.72±1.76)×10-2、(8.48±1.37)×10-2mm。煙熏2、4周組及恢復組肺泡直徑均大于正常組，煙熏4周組及恢復組均大于煙熏2周組(P均<0.01)，煙熏4周組與恢復組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

動物模型實驗是了解COPD發(fā)病機制和探索其治療方法的重要手段。目前COPD模型主要有脂多糖誘導模型、煙熏模型、吸入NO2模型、呼吸道感染模型、蛋白酶誘導模型、基因工程模型及兩個或多個模型聯(lián)合[3,4]。脂多糖誘導模型需行氣管暴露，是對小鼠的再次打擊，對實驗技術(shù)要求較高，且不符合臨床誘因；此外，脂多糖誘導的炎癥反應可以被糖皮質(zhì)激素抑制，但臨床上較多的COPD患者對糖皮質(zhì)激素不敏感[5]。煙熏模型最大的優(yōu)點在于能模擬COPD最主要的發(fā)病因素——吸煙，但其缺乏標準的暴露方法及檢測方法。吸入NO2制備慢性支氣管炎模型，長期氣管炎可導致肺氣腫，但此法操作復雜，費時耗力[6]；呼吸道感染法符合臨床誘因，但是必須確定一個合適的活菌感染量[7]；基因工程模型耗時長，費用高，且不符合臨床病因[8]；蛋白酶誘導模型可在較短時間內(nèi)迅速建模，對肺組織損害持續(xù)時間較長，但是其炎癥持續(xù)時間較短，不符合COPD的病理生理特點[9]。符合臨床實際的理想COPD動物模型應具備的條件[10]：①致傷因素與臨床COPD常見誘因基本一致；②必須有氣流阻塞存在，小氣道阻力增高、肺動態(tài)順應性下降；③氣道重塑；④可伴有氣道高反應性。COPD的病因不明確，目前認為與肺組織對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應有關(guān)，是基因與環(huán)境相互作用的結(jié)果[11]，其中環(huán)境因素中最重要的兩個因素是吸煙和感染[12]。流行病學資料表明，COPD是一個與吸煙關(guān)系密切的炎性疾病[13,14]。煙草中含有焦油、尼古丁及大量粉塵顆粒等幾千種化學物質(zhì)，長期吸煙可導致多種肺部炎癥性疾病，如慢性支氣管炎、COPD等[15,16]，患有COPD的吸煙患者戒煙后肺部炎癥仍持續(xù)存在[17]。煙熏法雖有一些缺點，如COPD患者絕大部分是主動吸煙，而煙熏法是被動吸煙，但卻是最符合COPD臨床誘因及發(fā)病機制的建模方法。

本研究采用煙熏法制備COPD小鼠模型，肺組織病理形態(tài)觀察結(jié)果顯示煙熏4周組病理學特征符合臨床上COPD的病理學改變?；謴徒M炎癥狀況較煙熏4周組減輕，但是肺泡無明顯減小，證明煙熏后小鼠肺氣腫是不可逆病變，亦說明該方法制備的COPD模型是穩(wěn)定的。中性粒細胞反映急性炎癥情況，而單核細胞及淋巴細胞則反映慢性炎癥情況。本研究各組肺組織病理形態(tài)顯示，煙熏2、4周組中性粒細胞少于單核細胞及淋巴細胞，考慮與本次實驗動物組織的取材時間有關(guān)，在實驗中取材時間定于最后一次煙熏后24 h，故反映急性炎癥的中性粒細胞較少，而單核細胞及淋巴細胞較多。

慢性炎癥刺激COPD患者肺組織中央氣道杯狀細胞增多及黏液腺增大，導致黏液高分泌，而黏蛋白是黏液中的重要組成部分，故BALF蛋白含量可反映氣道炎癥情況[18]。本研究結(jié)果顯示，BALF蛋白含量隨著煙熏時間的延長而增加，煙熏2、4周組及恢復組BALF蛋白含量均高于正常組；煙熏4周組及恢復組BALF蛋白含量均較煙熏2周組明顯增多；但停止煙熏后恢復組BALF蛋白含量明顯低于煙熏4周組，與以往的研究結(jié)果相符[18,19]。正常小鼠因氣道與外界相通，一些致病原進入氣道致使其產(chǎn)生少量黏蛋白，而煙熏則極大地刺激小鼠氣道杯狀細胞增生和黏液腺增多，分泌大量黏液；當停止吸煙后炎癥逐漸減輕，BALF蛋白含量逐漸減少。所以，BALF蛋白含量變化也證實此煙熏法能夠?qū)е轮夤苎装Y。

綜上所述，本研究成功采用單純煙熏4周法制備了COPD小鼠模型。該模型煙熏停止2周后各項指標穩(wěn)定，符合臨床COPD的病理生理過程。

[1] D′Souza AO, Shah M, Dhamane AD, et al. Clinical and economic burden of COPD in a medicaid population[J]. COPD, 2014,11(2):212-220.

[2] Maas AK, Mannino DM. Update on the management of chronic obstructive pulmonary disease[J]. F1000 Med Rep, 2010(12)：2.

[3] John G, Kohse K, Orasche J, et al. The composition of cigarette smoke determines inflammatory cell recruitment to the lung in COPD mouse models[J]. Clin Sci (Lond), 2014,126(3):207-221.

[4] Amano H, Murata K, Matsunaga H, et al. p38 Mitogen-activated protein kinase accelerates emphysema in mouse model of chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2014,34(4):299-306.

[5] Al FA, Sultana SA, Pureza MA, et al. Preferential macrophage recruitment and polarization in LPS-induced animal model for COPD: noninvasive tracking using MRI[J]. PLoS One, 2014,9(3):e90829.

[6] Wegmann M, Renz H, Herz U. Long-term NO2 exposure induces pulmonary inflammation and progressive development of airflow obstruction in C57BL/6 mice: a mouse model for chronic obstructive pulmonary disease[J]. Pathobiology, 2002,70(5):284-286.

[7] Ganesan S, Faris AN, Comstock AT, et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A[J]. Am J Pathol, 2012,180(1):61-72.

[8] Tsao PN, Su YN, Li H, et al. Overexpression of placenta growth factor contributes to the pathogenesis of pulmonary emphysema[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2004,169(4):505-511.

[9] Nakanishi K, Takeda Y, Tetsumoto S, et al. Involvement of endothelial apoptosis underlying chronic obstructive pulmonary disease-like phenotype in adiponectin-null mice: implications for therapy[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011,183(9):1164-1175.

[10] 鄭鴻翱,何韶衡.建立慢性阻塞性肺疾病動物模型方法的研究進展[J].中國實驗動物學報,2003,11(4):249-252.

[11] Pauwels RA, Buist AS, Calverley PM, et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO global initiative for chronic obstructive lung disease (GOLD) workshop summary[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001,163(5):1256-1276.

[12] Rabe KF, Hurd S, Anzueto A, et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2007,176(6):532-555.

[13] Andreas S, Herth FJ, Rittmeyer A, et al. Smoking, chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer[J]. Pneumologie, 2007,61(9):590-594.

[14] Stav D, Raz M. Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease among smokers aged 45 and up in Israel[J]. Isr Med Assoc J, 2007,9(11):800-802.

[15] Borgerding M, Klus H. Analysis of complex mixtures--cigarette smoke[J]. Exp Toxicol Pathol, 2005(57):43-73.

[16] Curtis JL, Freeman CM, Hogg JC. The immunopathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease: insights from recent research[J]. Proc Am Thorac Soc, 2007,4(7):512-521.

[17] Ind PW. COPD disease progression and airway inflammation: uncoupled by smoking cessation[J]. Eur Respir J, 2005,26(5):764-766.

[18] 張科東,馬冉,李征途,等.一種熏煙小鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立及鑒定[J].國際呼吸雜志,2012,32(21):1607-1611.

[19] 覃冬云,吳鐵,廖蕓蕓,等.構(gòu)建熏煙致慢性支氣管炎小鼠模型[J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(24):4697-4700.

國家自然科學基金資助項目(81460008)。

歐陽瑤(E-mail: ouyangyao116@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.011

R714.253

A

1002-266X(2016)32-0035-04

2015-09-04)