拔牙創(chuàng)不同處理方法對牙槽窩炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α濃度影響的研究

任麗珊　馮曉彤　李元帥　姬文婕　韓澤民

300162　天津市，武警后勤學院附屬醫(yī)院口腔科(任麗珊、李元帥、韓澤民)，心研所(馮曉彤、姬文婕)

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·論著·

拔牙創(chuàng)不同處理方法對牙槽窩炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α濃度影響的研究

任麗珊馮曉彤李元帥姬文婕韓澤民

300162天津市，武警后勤學院附屬醫(yī)院口腔科(任麗珊、李元帥、韓澤民)，心研所(馮曉彤、姬文婕)

【摘要】目的比較三種不同拔牙窩處理方法對牙槽窩炎性因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響 。方法選取150例需拔除慢性炎癥牙齒的患者，隨機分為3組，其中B組僅搔刮拔牙窩，C組為搔刮拔牙窩+0.9%氧化鈉溶液沖洗，D組為搔刮拔牙窩+1%過氧化氫溶液+0.9%氧化鈉溶液沖洗。并選取同期50例無炎癥拔牙患者為健康對照組(A組)，抽取牙槽窩內(nèi)血液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA)檢測炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的濃度。結(jié)果C、D組IL-1、IL-6、TNF-α分別與B組IL-1、IL-6、TNF-α濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與A組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C組IL-1、IL-6、TNF-α濃度與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論拔牙窩沖洗后牙槽窩血液炎性因子IL-I、IL-6、TNF-α的濃度與未沖洗比較明顯降低，接近無炎癥組，0.9%氧化鈉溶液沖洗與1%過氧化氫溶液沖洗的牙槽窩炎性因子濃度無明顯差異。

【關鍵詞】牙槽窩;沖洗;白介素-1；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

口腔種植外科目前在口腔局部及全口義齒修復領域已逐漸普及，研究表明牙列缺損后的種植修復效果明顯高于常規(guī)修復[1]。因此，越來越多的患者認識到種植牙的諸多優(yōu)點并逐漸接受這種修復方式。常規(guī)種植修復時機需等到拔牙創(chuàng)牙槽嵴吸收變化基本穩(wěn)定后方可進行,而在創(chuàng)口愈合的早期,如果拔牙創(chuàng)受到各種因素的干擾,會影響甚至延緩拔牙創(chuàng)骨重建[2]。有文獻表明，牙齒拔除后由于牙槽骨改建過程中受到內(nèi)外環(huán)境的影響，常導致拔牙區(qū)牙槽骨的吸收，骨密度及骨量的不足，影響骨結(jié)合時間及效果，從而增大了口腔臨床治療中種植以及修復的難度，因此，在拔牙窩內(nèi)牙槽骨重建時期，避免拔牙創(chuàng)及其周圍牙槽骨的吸收和萎縮，在后期種植修復，恢復生理功能和美觀上具有著重要的意義[3]。牙槽骨的改建、再生過程，是由破骨細胞和成骨細胞相互協(xié)調(diào)作用完成的[4]。有研究表明破骨細胞和成骨細胞的生長、分化除了受到系統(tǒng)因素、生長因子、機械力等作用外，炎性因子如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等也能夠通過直接或間接刺激OC和OB來調(diào)節(jié)骨代謝，在牙槽骨的修復重建中也發(fā)揮了重要的作用[5]。因此降低牙槽窩炎性因子的濃度，可以促進拔牙創(chuàng)新骨的形成，增強拔牙窩牙槽骨密度，提高種植修復中牙槽骨與種植體的骨結(jié)合程度，在臨床咬合系統(tǒng)的重建，生理功能的恢復上有重大的意義。本驗試研究拔牙創(chuàng)的三種不同處理方法對牙槽窩炎性因子濃度及牙槽骨重建的影響。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2015年4～7月于我院口腔科行牙拔除術(shù)患者150例，男79例，女71例；年齡18～43歲，平均年齡(33±7)歲。拔牙原因：齲壞70例，牙周病43例，阻生齒37例?；颊呔ㄟ^口腔臨床檢查和數(shù)字化攝影檢查診斷為牙周有慢性炎癥且符合拔除指征。計算機隨機例分為B組、C組和D組，每組50例。同時選擇50例拔除無炎癥牙齒的患者作為健康對照組(A組)。4組患者一般資料比較具有均衡性。

1.2材料與設備人IL-1酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)；人IL-6 ELISA試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)；人TNF-α ELISA試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)；1%過氧化氫溶液；0.9%氯化鈉注射液；Eppendorf 低溫高速離心機5804R；BIO-RAD酶標儀X-mark；海爾超低溫保存箱。

1.3樣品采集及處理于無菌環(huán)境下拔除患牙，根據(jù)不同分組處理牙槽窩后用1 ml注射器抽取牙槽窩血液0.5 ml置于1.5 ml EP管中，靜置20 min后離心(23℃，1 500 r/min，10 min)，取上清液，-70℃保存。見表1。

1.4檢測方法ELISA檢測炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的濃度。

表1　拔牙后牙槽窩不同處理方法

1.4.1實驗原理：采用雙抗體夾心法來測定拔牙創(chuàng)血中IL-1、IL-6、TNF-α的水平。分別用純化的IL-1、IL-6抗體、TNF-α抗體包被在3個96孔的微孔板上，制成固相抗體，向包被三種不同單抗的微孔中分別加入IL-1、IL-6、TNF-α，洗滌去掉未結(jié)合的成分后，再分別加入與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidise，HRP)標記的IL-1抗體、HRP標記的IL-6抗體、HRP標記的TNF-α抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，再次經(jīng)過徹底的洗滌后加底物TMB顯色。在HRP酶的催化作用下TMB轉(zhuǎn)化為藍色，最終在酸的作用下TMB的顏色由藍轉(zhuǎn)變?yōu)辄S。顏色的深淺同樣品中IL-1、IL-6、TNF-α的濃度呈正相關。用酶標儀在波長為450 nm的狀態(tài)下測定吸光度值(OD值)，通過標準曲線計算樣品中IL-1、IL-6、TNF-α的濃度。

1.4.2操作步驟

1.4.2.1提前30 min取出試劑盒，平衡至室溫。從已平衡至室溫的密封袋中取出抗體包被板。

1.4.2.2在酶標包被板上設標準品孔10孔，通過系列倍比稀釋將100 μl標準品(IL-1標準品濃度：180 ng/L；IL-6標準品濃度：90 ng/L；TNF-α標準品濃度：450 pg/ml)做成不同濃度后，加入包被板孔中(稀釋后的各孔加樣量均為50 μl。IL-1的標準品濃度分別為120、80、40、20、10 ng/L；IL-6的標準品濃度分別為60、40、20、10、5 ng/L；TNF-α的標準品濃度分別為300、200、100、50、25 pg/ml)。

1.4.2.3除標準孔外，再分別設立待測樣品孔和空白孔，其中空白孔不加待測樣品和酶標試劑，作為空白對照孔，其他操作與待測樣品孔相同。先將40 μl的樣品稀釋液加入到待測樣品孔，然后再加10 μl的待測樣品(將樣品濃度稀釋5倍)。

1.4.2.4用封板膜封住反應孔后，置于37℃溫育箱中溫育30 min。

1.4.2.5揭掉封板膜，將孔內(nèi)液體棄掉，甩干，每孔加滿已稀釋好的洗滌液，靜置30 s后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，重復洗板5次，拍干。

1.4.2.6除空白孔外，每孔加入酶標試劑50 μl，用封板膜封住反應孔后，置于37℃溫育箱中溫育30 min，洗板5次。

1.4.2.7向每孔中先加入50 μl的顯色劑A，再加入50 μl的顯色劑B，輕輕震蕩混勻，避光，置于37℃孵育箱，顯色15 min。

1.4.2.8每孔加入終止液50 μl，終止反應(此時孔內(nèi)顏色由藍色轉(zhuǎn)為黃色)。

1.4.2.9以空白孔調(diào)零，依次測量各孔波長為450 nm的的吸光度值(OD值)。

1.4.2.10結(jié)果判定：根據(jù)標準品的OD值繪制標準曲線，以標準品濃度作縱坐標，OD值作橫坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過待測樣品的OD值可在標準曲線上查出其相應的濃度。

2結(jié)果

2.14組牙槽窩IL-1濃度比較B組濃度值較高，C組、D組濃度值較低，B組分別與C組、D組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。C組與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。C、D組與A組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.24組的牙槽窩IL-6濃度比較B組濃度值較高，C組、D組濃度值較低，B組分別與C、D組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。C組與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C、D組與A組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.34組牙槽窩TNF-α濃度比較B組濃度值較高，C組、D組濃度值較低，B組分別與C、D組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。C組與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C、D組與A組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　4組患者拔牙后牙槽窩炎性因子濃度比較　±s

注：與B組比較，*P<0.01

3討論

炎癥是患牙拔除后牙槽骨改建過程中的重要影響因素，目前認為炎癥一般情況下可以通過某些炎性因子來調(diào)節(jié)牙槽骨的重建與修復,常見的炎性因子有：IL-1、IL-6、TNF-α、IL-11、IL-18等[6]。炎性因子對炎性反應和觸發(fā)骨發(fā)生至關重要,特別是TNF-α、IL-1、IL-6。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α對骨代謝的影響是可以通過介導破骨細胞的增殖、分化及成熟從而抑制骨生成,延緩骨修復過程[7]。它能夠直接刺激OC前體細胞，促進OC前體細胞的有絲分裂和分化,也可以間接激活成熟的OC,增強OC的骨吸收功能,加快牙槽骨的分解和吸收[8]。IL-1主要由巨噬細胞產(chǎn)生，可以同TNF-α共同作用，誘導破骨細胞的生成[9]。IL-1還能促進巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的產(chǎn)生，從而促進破骨細胞分化并增強其活力，除此之外，IL-1還被發(fā)現(xiàn)能夠抑制破骨細胞凋亡[10]。IL-6具有調(diào)節(jié)成、破骨細胞分化的功能,并能夠通過影響血管內(nèi)皮生長因子的分泌來促進骨質(zhì)礦化[11]。有研究顯示，IL-6具有雙重作用，既能促進骨生成，也能促進骨吸收,通常由內(nèi)環(huán)境決定哪個作用占優(yōu)勢[12]。在周圍組織大量存在其他炎性因子的情況下，IL-6的促骨吸收功能比較突出。因此，在牙拔除術(shù)后，牙槽骨改建過程中，多種炎性因子共同參與，相互協(xié)同，直接或間接作用于成破骨細胞，最終導致牙槽骨吸收。

骨量的丟失對今后種植修復治療都有很大的影響，因此如何保持牙槽骨骨量在也是近年來的研究熱點。在以往研究中，保持拔牙術(shù)后牙槽骨骨量的方法有很多：(1)微創(chuàng)拔牙法；(2)頰側(cè)骨板增高法；(3)牙槽窩封閉技術(shù)；(4)自體骨及人工骨的植入；(5)生物膜的應用;(6)生長因子配合載體植入術(shù)；(7)組織工程技術(shù)成骨等[13-15]。以上幾種方法經(jīng)實驗驗證均可明顯促進新骨形成,然而部分方法也有一定的局限性，長期效果也需進一步觀察。在實際臨床操作中因費用高和時間長的問題不能完全普及所有拔牙的患者。因此在治療有效的基礎上，將時間、費用和操作難度降到最低是本實驗的初衷。本試驗在拔牙窩處理中所使用的沖洗藥物為1%過氧化氫溶液和0.9%氯化鈉溶液，均為臨床常用藥物，相關費用低，時間短，操作難度低，患者能接受，可普及性很高。

藥物沖洗在臨床中常針對有重度炎癥伴有膿腫或瘺道的患牙拔除術(shù)后，而常規(guī)慢性炎癥患牙的拔除術(shù)后處理一般只有拔牙窩搔刮術(shù)，藥物沖洗并未完全普及。本實驗結(jié)果顯示：慢性炎癥牙齒拔除術(shù)后，牙槽窩搔刮+沖洗與單純搔刮拔牙窩相比牙槽窩內(nèi)炎性因子濃度明顯降低，與A組牙槽窩內(nèi)炎性因子濃度接近。拔牙后搔刮拔牙窩內(nèi)肉芽組織，原理上是減少與炎癥相關的細胞因子，而在此基礎上行藥物沖洗，進一步降低炎性因子濃度的假設通過本實驗證明是可行的。本實驗中1%過氧化氫溶液+0.9%氯化鈉溶液沖洗后牙槽窩炎性因子濃度明顯低于單純沖洗，雖然差異無統(tǒng)計學意義，但考慮與樣本例數(shù)少有關，這一方面有待擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，慢性炎癥牙齒拔除后的牙槽窩藥物沖洗可明顯降低炎性因子濃度，從而減少骨量的丟失，為此后種植修復打下良好的基礎。此方法操作簡單，耗材少，費用低，值得推廣，能讓廣大患者接受的臨床操作手段。

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(收稿日期：2015-12-21)

【中圖分類號】R 782.11

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)09-1324-03

通訊作者：韓澤民，300162天津市，武警后勤學院附屬醫(yī)院口腔科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.013

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