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    針刺預(yù)處理對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血性損傷的影響

    2016-05-11 08:25:49趙士弟
    關(guān)鍵詞:超氧化物歧化酶百會穴丙二醛

    黃 麗,王 春,趙士弟

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    針刺預(yù)處理對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血性損傷的影響

    黃麗1,王春2,趙士弟1

    [摘要]目的:研究針刺預(yù)處理百會穴+雙側(cè)足三里穴對腦缺血誘導(dǎo)的大鼠小腦浦肯野細(xì)胞損傷的影響。方法:將雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為正常對照組、針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴組(針刺穴位組)和針刺非穴位組,各10只。采用糖氧剝奪的腦缺血模型,觀察針刺預(yù)處理治療后大鼠小腦浦肯野細(xì)胞的存活率,檢測小腦組織中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。結(jié)果:與正常對照組比較,針刺非穴位組大鼠腦缺血后浦肯野細(xì)胞死亡率明顯增加,MDA水平明顯增高,SOD活性明顯降低(P<0.01) ;與針刺非穴位組比較,針刺穴位組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率明顯增加,小腦組織中MDA含量明顯降低,SOD活性明顯增加(P<0.01)。結(jié)論:針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血性損傷具有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與小腦組織中活性氧的生成減少和清除增加有關(guān)。

    [關(guān)鍵詞]腦缺血;百會穴;足三里穴;浦肯野細(xì)胞;丙二醛;超氧化物歧化酶;大鼠

    [作者單位]1.蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,安徽蚌埠233030; 2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽蚌埠233040

    缺血性腦血管疾病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。臨床上采取的很多治療措施如應(yīng)用谷氨酸受體阻斷劑、低溫療法等,雖然有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,但均不能完全改善由腦缺血導(dǎo)致的共濟(jì)失調(diào)和震顫等癥狀[1]。小腦性共濟(jì)失調(diào)和震顫與浦肯野細(xì)胞密切相關(guān)[2-3]。臨床研究[4-5]表明,針刺療法在治療ICVD方面發(fā)揮著越來越重要的作用。針刺預(yù)處理是指在腦缺血前給予針刺,從而對缺血后的腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用的現(xiàn)象。研究[6-7]表明,針刺預(yù)處理可以明顯地改善腦血液循環(huán),增加腦血流量,減輕腦細(xì)胞水腫,但其具體機(jī)制尚未完全明確。本實驗采用糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)的腦缺血模型,觀察針刺預(yù)處理百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率、小腦組織中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響,從自由基的角度探討針刺預(yù)處理對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血性損傷的保護(hù)機(jī)制,為改善ICVD患者的預(yù)后提供一定的實驗和理論參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物雄性SD大鼠30只,由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,體質(zhì)量(240±10) g,實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周。

    1.2試劑與設(shè)備MDA、SOD測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。NaCl、KCl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、dextrose、HEPES、KOH、EGTA、Mg2 +-ATP、Tris-GTP、葡萄糖酸鉀、NaOH均為Sigma公司產(chǎn)品; 95% O2和5% CO2購自合肥巨網(wǎng)氣體有限公司;振蕩切片機(jī)(美國VIBRATOME公司)。

    1.3溶液配制[8]人工腦脊液A組成(mmol/L) : 124 NaCl,3 KCl,1.3 NaH2PO4,26 NaHCO3,10 dextrose,5 HEPES,0.5 CaCl2和4 MgSO4; pH 7.35~7.45(1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)。人工腦脊液B組成(mmol/L) : 124 NaCl,3 KCl,1.3 NaH2PO4,26 NaHCO3,10 dextrose,5 HEPES,2.4 CaCl2和1.3 MgSO4,pH 7.35~7.45 (1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)。

    1.4腦片制備大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥0.1 mL麻醉,斷頭取出小腦,在充分氧合(通95% O2和5% CO2混合氣體)的冰水混合的人工腦脊液A中將小腦蚓部制備成400 μm腦片,然后迅速轉(zhuǎn)移至充分氧合的人工腦脊液B,在31°C條件下孵育[8]。

    1.5體外OGD腦缺血模型制備[9-10]將大鼠小腦腦片轉(zhuǎn)移至無氧(通95% N2和5% CO2混合氣體)無糖的人工腦脊液B培養(yǎng)液中培養(yǎng)0.5 h模擬缺血,制備OGD腦缺血模型。

    1.6實驗分組30只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴組(針刺穴位組)和針刺非穴位組各10只。

    1.6.1正常對照組未作針刺預(yù)處理的大鼠。腦片以充分氧合的人工腦脊液B培養(yǎng)2 h。

    1.6.2針刺穴位組針刺部位選擇百會穴和足三里穴[11]。大鼠于適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周后給予針刺預(yù)處理。兩人配合操作,一人抓取活體大鼠以固定,另一人以0.25 mm×25 mm毫針向百會穴平刺約3 mm,同時用0.25 mm×40 mm毫針向雙側(cè)足三里穴直刺約5 mm,每天2次,間歇5 min捻轉(zhuǎn)1次,每次持續(xù)30 min,連續(xù)刺激7 d后大鼠被斷頭取腦,制備成腦片。腦片先以充分氧合的人工腦脊液B培養(yǎng)1.5 h,再轉(zhuǎn)移至OGD液培養(yǎng)0.5 h。

    1.6.3針刺非穴位組針刺部位選擇頭部與腿部的各1個非穴位點。針刺方法、持續(xù)時間、腦片處理與針刺穴位組一致。

    1.7檢測指標(biāo)

    1.7.1形態(tài)學(xué)指標(biāo)缺血后的腦片置于4 %甲醛溶液中4℃保存24 h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,取腦片內(nèi)部組織做病理切片(距邊緣約100 μm組織以排除在腦片制備中直接受損的區(qū)域),并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,檢測浦肯野細(xì)胞存活率(即其未受損細(xì)胞百分比)。有下列特征之一則視為受損:細(xì)胞腫脹、空泡化或細(xì)胞固縮核深染[12]。腦片的每個區(qū)域至少有50個浦肯野細(xì)胞被計數(shù)或3個區(qū)域總計數(shù)>150個[9]。

    1.7.2生化檢測MDA含量及SOD活性取上述實驗各組大鼠小腦組織,勻漿后按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

    1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用方差分析和q檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對小腦浦肯野細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響正常對照組小腦浦肯野細(xì)胞胞膜清晰完整,無腫脹,無變性壞死,核仁清晰;針刺非穴位組可見浦肯野細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、變性壞死,細(xì)胞核固縮,細(xì)胞體皺縮變形,間質(zhì)水腫明顯;而針刺穴位組細(xì)胞損傷則較針刺非穴位組明顯減輕,僅有輕度水腫,細(xì)胞膜完整清晰,核仁明顯(見圖1~3)。2.2 3組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率、小腦組織中MDA和SOD活性比較與正常對照組比較,針刺非穴位組大鼠腦缺血后浦肯野細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.01) ;與針刺非穴位組比較,針刺穴位組浦肯野細(xì)胞的存活率明顯增加(P<0.01) ;與正常對照組比較,針刺非穴位組大鼠腦缺血后可使小腦組織中MDA水平明顯增高,SOD活性明顯降低(P<0.01) ;與針刺非穴位組比較,針刺穴位組大鼠小腦組織中MDA含量明顯降低,SOD活性明顯增加(P<0.01) (見表1)。

    表1 3組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率和小腦組織中MDA及SOD活性比較(±s)

    表1 3組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率和小腦組織中MDA及SOD活性比較(±s)

    q檢驗:與正常對照組比較**P<0.01;與針刺非穴位組比較▲▲P<0.01

    分組 n  細(xì)胞存活率/% MDA/ (mmol/100 mg prot) SOD/ (U/mg prot)正常對照組10  83.89±4.51  3.64±0.29  38.21±3.04針刺非穴位組 10  37.20±3.24** 6.28±0.34** 21.57±2.05**針刺穴位組 10  64.14±3.60**▲▲ 3.87±0.40▲▲ 33.05±2.60**▲▲F  — 376.25 178.35 107.73 P  — ?。?.01  <0.01 ?。?.01 MS組內(nèi)  —14.599 0.120 6.735

    3 討論

    ICVD是危害人類健康的常見病和多發(fā)病,具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點,給社會和家庭帶來極大的負(fù)擔(dān),其預(yù)防與治療一直是醫(yī)學(xué)界的重要課題之一。目前對于ICVD臨床上尚無十分有效的方法。近年來國外[13]研究的焦點集中在盡早恢復(fù)和改善缺血腦組織的血供以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能等方面。

    自1990年KITAGWA等[14]提出腦缺血預(yù)處理的概念以來,缺血預(yù)處理理論得到了學(xué)者的廣泛關(guān)注。缺血預(yù)處理可以通過激發(fā)機(jī)體自身的機(jī)制減輕一次或多次腦缺血所產(chǎn)生的損傷。近年來的研究[15]表明,缺血、缺氧、亞低溫甚至某些藥物均可作為預(yù)處理的手段,誘導(dǎo)腦缺血耐受的發(fā)生。但是由于大多數(shù)預(yù)處理手段的損傷性較大,因此決定了它們只能作為機(jī)制探討的手段而無法作為一種腦缺血前的預(yù)防措施直接應(yīng)用于臨床。針刺療法作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分之一,在古代就有了防止腦中風(fēng)的相關(guān)記載。中醫(yī)針刺療法具有相對安全、損傷小和操作簡單方便等優(yōu)點。近年研究[4-5]表明,中醫(yī)針刺療法在治療ICVD方面發(fā)揮著越來越重要的作用。因此,研究針刺預(yù)處理特定穴位對增加腦細(xì)胞對缺血的耐受機(jī)制可能具有非常重要的臨床應(yīng)用價值。

    本實驗以百會、足三里為針刺預(yù)處理用穴。百會穴位居顛頂,其深處即為腦,且為督脈經(jīng)穴,督脈也歸屬于腦,可見百會穴與腦聯(lián)系密切,是調(diào)節(jié)大腦功能的重要穴位。足三里穴位是“足陽明胃經(jīng)”的主要穴位之一,有學(xué)者[6-7]研究證實,針刺足三里穴可以促進(jìn)腦細(xì)胞功能的恢復(fù),提高神經(jīng)細(xì)胞的工作能力。因此,本實驗針刺預(yù)處理的主穴選擇百會穴和雙側(cè)足三里穴。實驗采用OGD的缺血模型,通過移除培養(yǎng)液中的葡萄糖和氧氣模擬腦缺血,其實驗結(jié)果類似在體動物模型,并可選擇特定類型的細(xì)胞進(jìn)行研究,是神經(jīng)科學(xué)研究中常用的腦缺血實驗?zāi)P停?-10]。

    研究[15]表明,細(xì)胞內(nèi)自由基損害是腦缺血損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一。本實驗通過觀察針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率、小腦組織中MDA的含量和SOD活性的影響,從自由基的角度對針刺預(yù)處理后缺血性小腦浦肯野細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,是清除自由基的首要物質(zhì),它可對抗因氧自由基對細(xì)胞造成的損傷,修復(fù)受損細(xì)胞,在機(jī)體的氧化與抗氧化平衡中起著極其重要的作用,其活性的高低也間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。腦組織中富含脂質(zhì),當(dāng)腦缺血性損傷時,機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基,后者使脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,如MDA等。因此,測定小腦組織中MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映腦細(xì)胞損傷的程度。

    本實驗結(jié)果顯示,與正常對照組比較,針刺非穴位組的大鼠腦缺血后可使小腦浦肯野細(xì)胞的死亡數(shù)明顯增加,細(xì)胞存活率降低,MDA水平明顯增高,SOD活性明顯降低(P<0.01) ;與針刺非穴位組相比,針刺穴位組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活數(shù)明顯增加,細(xì)胞存活率增加,小腦組織中MDA含量明顯降低,SOD活性明顯增加(P<0.01),表明針刺預(yù)處理百會穴+足三里穴可以通過減少神經(jīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度,減輕腦缺血導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的紊亂,穩(wěn)定細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜及其功能,使神經(jīng)細(xì)胞的功能得以維持,同時可以提高機(jī)體酶促抗氧化防御系統(tǒng)的功能,增加其清除氧自由基的能力來保護(hù)腦缺血導(dǎo)致的小腦浦肯野細(xì)胞的損傷。

    綜上所述,針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞的缺血性損傷具有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與小腦組織中活性氧的生成減少和清除增加有關(guān)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (本文編輯馬啟)

    ·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

    Influence of acupuncture pretreatment on ischemia-induced functional impairment of cerebellar Purkenje cells in rats

    HUANG Li1,WANG Chun2,ZHAO Shi-di1

    (1.Department of Pathophysiology,Bengbu Medical College,Bengbu Anhui 233030; 2.Department of Endocrinology,The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu Anhui 233040,China)

    [Abstract]Objective: To investigate the influence of acupuncture pretreatment Baihui-point and bilateral Zusanli-point on ischemiainduced impairment of cerebellar Purkenje cells.Methods: Thirty male SD rats were randomly divided into three groups: control group,acupuncture pretreatment in Baihui-point and bilateral Zusanli-point group and pretreatment in non acupuncture point group,10 rats in each group.The oxygen-glucose deprivation model was established,the survival rate of Purkinje cells,malondiadehyde(MDA) content and superoxide dismutase(SOD) activity were detected during the ischemia period after the rats were acupunctured.Results: Compared with the control,the survival rate of Purkinje cells was lower,MDA content was increased and SOD activity was decreased significantly in non-acupuncture pretreatment group(P<0.01).Compared with the non-acupuncture pretreatment group,the survival rate of Purkinje cells was increased,MDA content was decreased,and SOD activity was increased in the acupuncture pretreatment in Baihui-point and bilateral Zusanli-point group(P<0.01).Conclusions: Acupuncture pretreatment to Baihui-point and bilateral Zusanli-point prevented ischemia-induced functional impairment of cerebellar Purkenje cells,the protective mechanism may be related to reduce the production of reactive oxygen species and promote the clearance in cerebellar Purkenje cells.

    [Key words]ischemia; Baihui-point; Zusanli-point; Purkenje cells; malondiadehyde; superoxide dismutase; rat

    [通信作者]趙士弟,碩士研究生導(dǎo)師,教授.E-mail: zhsdi@126.com

    [作者簡介]黃麗(1982-),女,碩士,講師.

    [基金項目]安徽省科技廳自然科學(xué)基金項目(1308085QH147; 1408085MH185) ;蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究項目(Byky1252)

    [收稿日期]2014-11-26

    [文章編號]1000-2200(2016) 01-0007-04

    [中圖法分類號]R 743.31

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.01.002

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