SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測PRRSV方法的建立

羅忠永，王　印，楊澤曉

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 動物檢疫實驗室，四川成都 611130)

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研究論文

SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測PRRSV方法的建立

羅忠永，王印*，楊澤曉

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 動物檢疫實驗室，四川成都 611130)

摘要：根據(jù)編碼PRRSV M蛋白的基因序列設計用于SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR擴增的引物，通過溫度梯度法優(yōu)化反應體系；以不同科屬常見豬致病性RNA病毒疫苗驗證該檢測方法的特異性，參考國內(nèi)PRRSV分子流行病學特征，選擇基因型代表性的2株疫苗株驗證該檢測方法的穩(wěn)定性；以10倍梯度稀釋的質粒為標準品擴增并構建標準曲線,探究該檢測方法的靈敏度,隨機挑取10份保存的PRRSV陽性病料和10份陰性病料同時使用農(nóng)業(yè)部推薦的PRRSV RT-PCR檢疫標準方法和建立的方法進行檢測,以確定2種方法檢測的符合率。結果顯示，使用建立的方法可以在54.4℃ 80 min內(nèi)完成對PRRSV的檢測，該檢測方法具有特異性和穩(wěn)定性；檢測靈敏度為6.8×10 拷貝/μL；以Ct值為橫坐標，擴增序列拷貝濃度的對數(shù)值為縱坐標，得到標準曲線，方程為y=-3.411 x+39.002，R2=0.999；對隨機挑取的10份PRRSV陽性病料和10份陰性病料進行檢測,結果2種方法檢測結果的符合率100%。結果表明，成功建立了PRRSV SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR快速檢測方法，為臨床提供了一種很好的檢測手段。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；M蛋白；SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。該病于1987年首次在美國發(fā)生，隨后迅速在世界大范圍流行[1]。我國自1996年暴發(fā)PRRS以來，已遍及全國各地，成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疫病之一[2-4]。2006年夏秋季節(jié)，我國南方部分省市相繼暴發(fā)“豬高熱病”疫情，經(jīng)診斷該病主要致病病原為高致病性豬藍耳病病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRSV)，該病半年內(nèi)幾乎傳遍了大半個中國，造成大批豬只死亡，引起巨大的經(jīng)濟損失[5]。PRRSV是一種表面相對光滑且有囊膜的病毒，其直徑大小約50 nm～65 nm，屬于套式病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈病毒屬(Arterivirus)[6]。根據(jù)PRRSV抗原性、遺傳特性和致病性將其分為2個基因型，歐洲Ⅰ型和美洲Ⅱ型，有研究表明美洲Ⅱ型是由歐洲Ⅰ型隔離變異而來[7]。PRRSV為單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒，基因組大小約為15 kb，結構為5′-UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF3-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-UTR-poly(A)-3′，共含有10個開放性閱讀框(ORFs)[8]。HP-PRRSV基因型屬于美洲型，基因組結構與經(jīng)典的PRRSV有所不同，其Nsp2基因有兩處不連續(xù)的缺失，一處缺失3 nt，另一處缺失87 nt；氨基酸水平缺失30 aa[9]。病毒蛋白的表達機制是位于基因組3′端的結構基因通過負鏈不連續(xù)轉錄機制進行亞基因的轉錄，產(chǎn)生6個亞基因組mRNA表達蛋白[10]。亞基因組結構mRNA的轉錄產(chǎn)物具有與基因組相同的5′-UTR、3′-UTR及poly(A)尾巴[11]。ORF1a和ORF1b兩個開放性閱讀框長度約占基因組全長的80%，分別編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab，分別被裂解為9種和4種非結構蛋白[12]。ORF2-7分別編碼病毒結構蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白[13]。主要結構蛋白為GP5、M和N蛋白。M白是非糖基化的囊膜蛋白，分子質量約為18 ku～19 ku，是所有毒株中最保守的結構蛋白，M蛋白不僅能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，也能刺激豬產(chǎn)生最強的T淋巴細胞免疫應答，在細胞免疫中起著重要作用[14]。

熒光定量PCR是20世紀90年代中期發(fā)展的一種新型核酸定量技術，基于熒光能量傳遞技術，能量由供體發(fā)色基團轉移到受體發(fā)色基團，受體熒光染料發(fā)出的熒光信號強度與DNA產(chǎn)量成正比。檢測PCR過程的熒光信號，將該動態(tài)曲線與標準曲線對比可以獲得靶序列的起始濃度；或者對比不同靶序列的動態(tài)擴增曲線，獲得不同靶序列起始狀態(tài)的相對含量。本研究依據(jù)編碼PRRSV M蛋白基因保守序列設計引物，建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR快速定量檢測PRRSV核酸的方法，并對該方法的特異性、穩(wěn)定性、靈敏度以及與農(nóng)業(yè)部推薦的PRRSV標準檢測方法的結果進行比較，以期為臨床PRRSV的檢測提供一種較好的手段。

1材料與方法

1.1材料

NANODROP 2000分光光度計，Thermo公司產(chǎn)品；CFX ConnectTMOptics Module熒光定量PCR檢測系統(tǒng)及其耗材，Bio-Rad公司產(chǎn)品；PRRSV、HP-PRRSV疫苗,上海海利生物技術股份有限公司產(chǎn)品；CSFV、JEV、PEDV疫苗，中牧實業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；SYBR Premix DimerEraserTM，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成從GenBank下載編碼PRRSV美洲型和歐洲型參考毒株的M蛋白基因序列或從全基因組序列中找出M蛋白基因序列，利用 DNA Star軟件分析編碼M蛋白的基因序列中的保守片段，利用Primer Premier6和Oligo7設計1對引物(表1)用于擴增編碼PRRSV M蛋白基因154 bp片段，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，PAGE純化。

表1　PRRSV M基因片段擴增引物

1.2.2標準質粒的構建參照TaKaRa RNAiso Plus使用說明提取PRRSV CH-1R株疫苗RNA，使用TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit進行病毒全基因組cDNA合成，以合成的cDNA為模板，引物F和R，使用2×PFU PCR MaserMix擴增目的片段，50 μL反應體系，退火溫度54.4℃(由Primer Premier6和Oligo7軟件分析給出)。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L agarose電泳確認后，剩余45 μL產(chǎn)物電泳分離后按通用型DNA純化回收試劑盒說明書回收目的片段。使用Thermo NANODROP 2000分光光度計測量純化后模板片段核酸濃度，參照加A反應液說明書對模板片段3′加A。將加A產(chǎn)物直接連接T-Vector pMDTM19(Simple)，連接反應按DNA Ligation Kit Ver.2.1說明書操作，連接產(chǎn)物轉化Dpα感受態(tài)細胞，藍白斑篩選后挑取白色菌落過夜培養(yǎng)使用質粒小提取試劑盒提取質粒，用Thermo NANODROP 2000分光光度計測量質粒濃度，并將質粒送交英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行雙向測序。

1.2.3檢測體系的優(yōu)化以1.2.2制備的質粒為模板，以Primer Premier6和Oligo7推薦的退火溫度為中心利用棋盤法對退火溫度進行優(yōu)化。反應體系：DimerEraser(Perfect Real Time)2×10 μL，滅菌ddH2O 6 μL，引物F(濃度10 μmol/L) 1 μL，引物R(濃度10 μmol/L) 1 μL，10×梯度稀釋(10-3、10-4、10-5、10-6)的標準質粒 2 μL。每個溫度或梯度3個重復。反應條件:95℃ 3 min；95℃ 15 s，52.9℃～56.4℃ 20 s(共8個溫度梯度，相鄰梯度差別0.5℃),40個循環(huán)。

1.2.4特異性和穩(wěn)定性檢測參照TaKaRa RNAiso Plus使用說明分別提取PRRSV CH-1R株、HP-PRRSV NM1株、CSFV、JEV、PEDV等疫苗病毒核酸，合成病毒全基因組cDNA，檢驗檢測所建立方法的特異性和穩(wěn)定性，以滅菌ddH2O為模板的反應體系作為陰性對照。反應體系;DimerEraser(Perfect real time)2×10 μL，滅菌ddH2O 6 μL，引物F(濃度10 μmol/L) 1 μL，引物R(濃度10 μmol/L) 1 μL，模板2 μL。反應條件：95℃ 3 min；95℃ 10 s,54.4℃ 20 s，40個循環(huán)。反應結束后取5 μL產(chǎn)物經(jīng)10 g/L agarose電泳,BIO-RAD Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.2.5標準曲線的制作和靈敏度檢測以1.2.2提取的質粒為標準品，計算標準品的拷貝濃度，以10倍梯度稀釋標準品，每個梯度3個重復，檢測建立方法的靈敏度，選取線性的拷貝濃度區(qū)間制作標準曲線，以滅菌ddH2O為模板的反應體系作為陰性對照。反應條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，54.4℃ 20 s，40個循環(huán)。反應體系：DimerEraser(Perfect real time)2×10 μL，滅菌ddH2O 6 μL，引物F(濃度10 μmol/L) 1 μL，引物R(濃度10 μmol/L) 1 μL，10倍梯度稀釋(100～109)質粒 2 μL；每個梯度3個重復。

1.2.6檢測結果的符合率隨機挑取10份保存的PRRSV陽性病料和10份陰性病料同時使用農(nóng)業(yè)部推薦的PRRSV RT-PCR檢疫標準方法和建立的方法進行檢測，確定2種方法檢測的符合率。

2結果

2.1質粒測序結果

將質粒測序結果進行Blast比對,結果顯示，擴增的M基因片段與GenBank上公布的PRRSVCH-1R相應序列同源性為100%，說明成功構建了正確的標準質粒(圖1)。

2.2檢測體系的優(yōu)化

以Primer Premier6和Oligo7推薦的退火溫度為中心進行退火溫度的優(yōu)化。結果顯示在54.4℃一定溫度梯度內(nèi)目的片段均可以獲得很好地特異性擴增(圖2)，同時也說明該檢測體系特異性擴增的退火溫度范圍較寬，具有很好的適用性,綜合考慮后選擇54.4℃作為退火溫度。

圖1　序列同源性比對

圖2　退火溫度優(yōu)化的動態(tài)曲線

2.3特異性和穩(wěn)定性測定結果

以CSFV、JEV、PEDV檢驗檢測體系的特異性，以PRRSV CH-1R株和HP-PRRSV NM1株檢驗檢測體系的穩(wěn)定性。結果顯示,該檢測體系能很好地擴增PRRSV CH-1R株和HP-PRRSV NM1株154 bp片段(圖3)，而CSFV、JEV、PEDV和陰性對照均無擴增條帶，動態(tài)曲線和熔解曲線特征符合預期，說明該檢測體系具有很好的特異性和穩(wěn)定性。

2.4標準曲線制作和靈敏度檢測

以10倍梯度稀釋標準品，每個梯度3個重復，檢測建立的熒光定量PCR檢測方法的靈敏度，選取線性的拷貝濃度區(qū)間制作標準曲線，以滅菌ddH2O為模板的反應體系作為陰性對照。結果顯示，該檢測方法的靈敏度為6.8×10 拷貝/μL。以Ct值為橫坐標，擴增序列拷貝濃度對數(shù)值為縱坐標，得到標準曲線；方程為y=-3.411x+39.002，R2=0.999(圖4和圖5)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.PRRSV;2.HP-PRRSV;3.CSFV;4.JEV;5.PEDV;6.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.PRRSV;2.HP-PRRSV;3.CSFV;4.JEV;5.PEDV;6.Negative control

圖3引物有效性和特異性驗證

Fig.3Verification of effectiveness and specificity of primers

0～9.100-9拷貝/μL；NC.陰性對照

0-9.100-9copies/μL；NC.Negative control

圖4靈敏度檢測擴增曲線

Fig.4Dynamic curve of sensitivity test

圖5　制備的標準曲線

2.5與農(nóng)業(yè)部推薦RT-PCR檢疫標準的符合率

隨機挑取10份保存的PRRSV陽性病料和陰性病料同時使用農(nóng)業(yè)部推薦的PRRSV RT-PCR檢疫標準方法和建立的方法進行檢測，結果顯示，10份PRRSV陽性病料2種檢測方法的檢測結果均為陽性，10份陰性病料2種檢測方法的檢測結果均為陰性；說明建立的方法的檢測結果與農(nóng)業(yè)部推薦的檢測方法的結果符合率為100%。

3討論

SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法建立的難點在于選擇合適的擴增靶序列，研究發(fā)現(xiàn)PRRSV各毒株核酸序列之間的變異很大，因此，為保證建立的檢測方法具有穩(wěn)定性和可應用性，必須在基因組內(nèi)尋找可靠的保守序列。對PRRSV毒株全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)Nsp2基因序列差異較大，基于Nsp2基因序列建立鑒別PRRSV高致病株和經(jīng)典株SYBR Green-Ⅰ 實時熒光定量PCR方法需要設計簡并引物，且較難獲得穩(wěn)定的反應體系[1]；M蛋白基因則相對保守，是所有毒株中最保守的結構蛋白。本研究選擇M基因的保守序列設計引物，沒有選擇Nsp2基因缺失區(qū)設計引物，因此無法區(qū)分PRRSV和HP-PRRSV。為了保證試驗的嚴謹性，隨機挑選PRRSV M蛋白基因30 nt左右的核酸片段進行Blast比對，未發(fā)現(xiàn)與其他生物體基因序列有同源片段，保證了M蛋白基因序列是PRRSV特有的。此外，筆者還通過核酸二級結構分析預測軟件對M蛋白核酸序列進行二級結構分析，盡量避免在二級結構區(qū)設計擴增。同時，本研究中選擇染料法而沒有選擇探針法，可以避免探針序列對反應體系的干擾，降低試驗難度，保證檢測體系的穩(wěn)定性。本試驗成功建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測PRRSV的方法，結果顯示,在101拷貝/μL～109拷貝/μL有很好的線性關系，檢測下限為10拷貝/μL。以CSFV、JEV、PEDV的cDNA為模板均無擴增條帶，說明該對引物特異性良好；國內(nèi)流行基因型疫苗株PRRSV CH-1R株和HP-PRRSV NM1株驗證引物的穩(wěn)定性；同時退火溫度優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)該對檢測體系特異性擴增的退火溫度范圍較寬，基于以上說明該檢測體系具有較強的可應用性。隨機挑取10份保存PRRSV陽性病料，經(jīng)本檢測方法檢測結果均為陽性，10份陰性病料2種檢測方法的檢測結果均為陰性；與農(nóng)業(yè)部推薦的RT-PCR檢測方法檢測結果的符合率為100%，說明建立的檢測方法的檢測結果的具有可信度。

我國自1996年暴發(fā)PRRS以來，已遍及全國各地，成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疫病之一。對PRRSV的快速準確檢測是控制PRRS傳播，保證食品衛(wèi)生安全的重要措施。本研究選擇PRRSV M蛋白基因保守序列設計引物，通過SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR快速定量檢測PRRSV核酸。該檢測系統(tǒng)具有很高的特異性和穩(wěn)定性；與農(nóng)業(yè)部推薦檢疫標準符合率為100%，為豬繁殖與呼吸綜合征病毒提供了一個快速簡便的檢測方法。

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Establishment of SYBR Green Ⅰ Real-time Fluorescence Quantitative PCR Method for Detection of PRRSV

LUO Zhong-yong，WANG Yin，YANG Ze-xiao

(AnimalQuarantineLaboratory,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgricultureUniversity,Chengdu,Sichuan,611130,China)

Abstract:Primers were designed for SYBR Green Ⅰ real-time fluorescence quantitative PCR according to the PRRSV M protein.Different temperature gradient results were checked to optimize the reaction system.The specificity and stability of the detection method were verified through different genera of common swine pathogenic RNA virus vaccine and 2 representative genetype vaccine strains which were selected on the basis of the domestic molecular epidemiological characteristics of PRRSV.A standard curve was constructed and the sensitivity of this detection method was explored with the plasmid which was diluted in 10 times of gradient.10 conserved PRRSV positive samples and 10 conserved PRRSV negative samples were selected randomly to research the coincidence rate of the constructed detection and quarantine standards recommended by the Ministry of agriculture.The results showed that detection could be completed within 80 min when the temperature was set at 54.4℃,using the two-step detection system.The detection method has good specificity and stability.The detection sensitivity could as low as 6.8×102copies/L.The standard curve was the equation (y=-3.411x+39.002, R2 = 0.999) when the Ct value was selected as the abscissa and the amplified sequences of numerical was selected as ordinate.The detection result was in line with the quarantine standards recommended by the Ministry of Agriculture with the randomly selected porcine samples.The test results showed that the SYBR Green Ⅰ real-time fluorescence quantitative PCR method was established successfully which could provide a good means for clinical detection.

Key words:PRRSV;M protein; Green Ⅰ SYBR real-time fluorescence quantitative PCR

文章編號:1007-5038(2016)04-0001-05

中圖分類號:S852.659.6

文獻標識碼:A

作者簡介：羅忠永(1992-)，男，河南潢川人，碩士研究生，主要從事分子生物學研究。*通訊作者

基金項目：“十二五”國家科技支持計劃項目(2013BAD12B04)

收稿日期：2015-10-12