不同基因型幽門螺桿菌對人胃黏膜上皮細(xì)胞引起免疫損傷的作用

136000　吉林省四平市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科(朱立寧，姚志新)；212001　鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院消化內(nèi)科(徐岷，張尤歷)

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·臨床研究·

不同基因型幽門螺桿菌對人胃黏膜上皮細(xì)胞引起免疫損傷的作用

朱立寧徐岷張尤歷姚志新

136000吉林省四平市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科(朱立寧，姚志新)；212001鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院消化內(nèi)科(徐岷，張尤歷)

幽門螺桿菌(Hp)是一種革蘭氏陰性微需氧螺旋狀細(xì)菌，其與慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌等疾病密切相關(guān)。國際癌癥機(jī)構(gòu)已將Hp列為Ⅰ級致癌因子。Hp感染在全世界非常普遍，然而只有少部分最終在其他誘因的共同作用下導(dǎo)致胃癌的發(fā)生，提示不同基因型的Hp在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用[1]。Hp含有的CagA基因及VacA基因分別編碼細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白及空泡毒素，根據(jù)兩種基因表達(dá)情況將Hp菌株分為：Ⅰ型含有CagA及VacA基因，并表達(dá)兩種蛋白(即CagA+VacA+)；Ⅱ型不含CagA基因，不表達(dá)兩種蛋白(即CagA-VacA-)；以及一些中間表達(dá)型，即表達(dá)一種毒力因子(即CagA+VacA-和CagA-VacA+)。本研究以不同基因型的Hp與胃黏膜上皮細(xì)胞共孵育，檢測炎性因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-10的水平變化，以揭示不同基因型Hp的毒力變化及其對免疫微環(huán)境的影響，探討不同基因型的Hp對胃黏膜炎性反應(yīng)的影響和致瘤性。

1材料和方法

1.1材料

人胃黏膜上皮細(xì)胞株(GES-1)來自江蘇大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞庫；國際標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637(CagA+VacA+)由英國胃腸病學(xué)會主席英國諾丁漢大學(xué)王后醫(yī)學(xué)中心教授Atherton饋贈；菌株S32(CagA+VacA-)、Z47(CagA-VacA+)、S71(CagA-VacA-)來自江蘇大學(xué)生命科學(xué)院菌株庫。主要試劑及儀器：哥倫比亞培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，人HpVacA ELISA試劑盒，人IL-8、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒，分光光度計(jì)，PCR儀。

1.2方法1.2.1Hp培養(yǎng)及基因鑒定菌株接種于哥倫比亞培養(yǎng)基(哥倫比亞培養(yǎng)瓊脂加10%脫纖維羊血及選擇性抗生素)，37℃微需氧條件下培養(yǎng)72～96 h。將菌株提取基因組后采用PCR方法鑒定CagA+及CagA-的菌株，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CagA基因引物：上游5′-GCCACTACCACCACCGACAT-3′，下游5′-TGCCTAGCTCCAGGACCAC-3′(上海生工技術(shù)有限公司)，PCR產(chǎn)物長266 bp。經(jīng)人HpVacA ELISA試劑盒鑒定VacA+及VacA-的菌株。

1.2.2GES-1培養(yǎng)將人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1采用DMEM加10%小牛血清常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長良好時(shí)用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Hp感染細(xì)胞模型的建立將處于指數(shù)生長期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×105/mL，吸取懸液于24孔培養(yǎng)板中(每孔1 mL)貼壁培養(yǎng)過夜。用分光光度計(jì)調(diào)整Hp濃度為1.0×109CFU/mL(A660=1×108CFU/mL)，分別取4種不同菌株的菌液100 μL加入培養(yǎng)板中，取100 μL布氏肉湯加入培養(yǎng)板中作為對照，每組重復(fù)24孔，培養(yǎng)箱共孵育，取8 h培養(yǎng)上清置于-70℃保存(共孵育超過10 h則有細(xì)胞不同程度脫壁、變形及死亡)，用于行ELISA檢測。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組將布氏肉湯處理細(xì)胞的上清液作為對照組，將4種不同基因型Hp菌株(CagA-VacA-型、CagA-VacA+型、CagA+VacA-型、CagA+VacA+型)處理細(xì)胞的上清液，分別定為CagA-VacA-組、CagA-VacA+組、CagA+VacA-組及CagA+VacA+組。

1.2.5ELISA檢測IL-8、IL-10、TNF-α含量嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，450 nm波長讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線取得上述待測品濃度值。

2結(jié)果

2.1不同基因型Hp菌株的篩選

提取HpDNA，以CagA基因引物進(jìn)行PCR鑒定，樣本瓊脂糖凝膠電泳，在266 bp處可見陽性擴(kuò)增條帶，篩選出CagA+及CagA-的菌株，結(jié)果見圖1；Hp培養(yǎng)后，PBS洗滌、離心，留取上清，經(jīng)HpVacA ELISA試劑盒篩選出VacA+及VacA-的菌株，結(jié)果見表1。經(jīng)上述兩種方法從菌株庫中分離出4種不同基因型的Hp，分別為：NCTC11637(CagA+VacA+)、S32(CagA+VacA-)、Z47(CagA-VacA+)和S71(CagA-VacA-)。

注：M為DL 2000 Marker；泳道1為Z47菌株；2為S71菌株；3為NCTC11637菌株；4為S32菌株。3、4可見266 bp CagA基因PCR擴(kuò)增片段，1、2未見CagA基因PCR擴(kuò)增片段

圖1　CagA基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2不同基因型Hp菌株對胃上皮細(xì)胞分泌IL-8水平的影響

CagA+VacA+組及CagA+VacA-組IL-8濃度為(58.11±4.15)pg/mL、(56.38±4.40)pg/mL，高于CagA-VacA+組、CagA-VacA-組及對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；后者IL-8濃度分別為(52.32±3.18)pg/mL、(50.84±3.52)pg/mL和(51.30±3.16)pg/mL。見表2。

表2　不同組別上清中細(xì)胞因子水平比較±s，pg/mL)

注：與對照組、CagA-VacA-組及CagA-VacA+組相比，aP<0.01

2.3不同基因型Hp菌株對于胃上皮細(xì)胞分泌TNF-α水平的影響

CagA+VacA+組及CagA+VacA-組TNF-α濃度為(5.17±0.77)pg/mL、(5.03±0.86)pg/mL，高于CagA-VacA+組、CagA-VacA-組及對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；后者TNF-α濃度分別為(4.20±1.29)pg/mL、(3.88±1.17)pg/mL和(4.17±1.20)pg/mL。見表2。

2.4不同基因型Hp菌株對胃上皮細(xì)胞分泌IL-10水平的影響

CagA+VacA+組及CagA+VacA-組IL-10濃度分別為(7.99±1.48)pg/mL、(8.27±1.60)pg/mL，低于CagA-VacA+組、CagA-VacA-組及對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；后者IL-10濃度分別為(10.35±1.47)pg/mL、(10.06±1.78)pg/mL和(10.52±1.65)pg/mL。見表2。

3討論

Hp定植于胃黏膜上皮細(xì)胞后，因受到Hp菌體成分及外泌毒素的刺激而合成多種促炎因子，趨化多種免疫相關(guān)細(xì)胞聚集到胃黏膜固有層，活化的免疫細(xì)胞繼續(xù)釋放細(xì)胞因子，募集更多免疫細(xì)胞，形成瀑布式循環(huán)反應(yīng)?；颊叱霈F(xiàn)明顯臨床癥狀時(shí)，各種細(xì)胞因子在胃黏膜內(nèi)高表達(dá)或低表達(dá)，并伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，這些表現(xiàn)是從Hp定植于胃黏膜上皮細(xì)胞開始的[2-3]。本研究關(guān)注了不同基因型Hp與胃上皮細(xì)胞作用時(shí)，胃上皮細(xì)胞來源的IL-8、TNF-α、IL-10的表達(dá)水平，而且這些細(xì)胞因子與Hp導(dǎo)致的后續(xù)的炎性細(xì)胞浸潤等病理生理過程密切相關(guān)。

IL-8和TNF-α在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。IL-8在Hp陽性的胃竇黏膜中表達(dá)較Hp陰性者明顯增加，且與炎性程度呈正相關(guān)[4]。在慢性胃炎、消化性潰瘍患者中，Hp陽性患者胃竇黏膜上皮細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)高于Hp陰性患者，且與Hp密度、炎性細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)[5]。TNF-α除了抗瘤細(xì)胞活性外，還可以通過影響靶細(xì)胞膜的磷脂代謝引起細(xì)胞凋亡和組織損傷[6]，Hp感染后，TNF-α分泌增加，造成胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡與增殖平衡失調(diào)，這可能是引起消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌的重要機(jī)制[7-8]。IL-10有很強(qiáng)的抗炎作用，可以抑制IL-8、TNF-α等多種炎性因子的合成，其在Hp致病中可能有類似的效應(yīng)。在胃部疾病中，各種損傷因子可改變胃黏膜的微環(huán)境，導(dǎo)致促炎與抗炎細(xì)胞因子之間的失衡，如IL-8、TNF-α等的上調(diào)，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)，IL-10則通過調(diào)節(jié)免疫、抑制促炎因子的分泌和活性，起著保護(hù)黏膜、減少組織損傷的作用[9]。機(jī)體受到病原體刺激后，會產(chǎn)生炎性反應(yīng)，促炎因子和抑炎因子相互制約，共同起著清除病原體、恢復(fù)機(jī)體免疫穩(wěn)定狀態(tài)的作用。Hp感染后，可誘導(dǎo)胃黏膜產(chǎn)生TH1優(yōu)勢的免疫反應(yīng)，分泌大量的促炎細(xì)胞因子(如IL-8、TNF-α)，造成黏膜的免疫損傷，與此同時(shí)TH2細(xì)胞受到抑制，分泌IL-10減少，導(dǎo)致B細(xì)胞分泌的IgA減少，不能有效清除Hp，使Hp持續(xù)存在，炎性反應(yīng)持續(xù)存在[10]。

本研究提示，Hp感染人胃黏膜后，IL-8、TNF-α、IL-10分泌水平受CagA+基因型Hp影響，而與VacA+基因型Hp無關(guān)。因此，CagA+基因型Hp菌株定植于胃黏膜，可打破IL-8、TNF-α、IL-10分泌水平的平衡，易引起細(xì)胞微環(huán)境免疫失衡，導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞損傷，從而引起胃黏膜上皮細(xì)胞過度凋亡，造成胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡與增殖平衡失調(diào)。從免疫原理分析，CagA+基因型Hp菌株具有較強(qiáng)的毒力。

通過不同基因型的Hp對胃黏膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)IL-8、TNF-α、IL-10分泌能力差異的分析，揭示了CagA+基因型Hp菌株具有較強(qiáng)的毒力，對胃黏膜上皮細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響明顯，說明CagA+基因型Hp菌株介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可增加胃黏膜損傷，易導(dǎo)致胃黏膜萎縮，并進(jìn)展為慢性萎縮性胃炎，甚至胃癌。因此，Hp基因分型對于指導(dǎo)臨床治療及判斷預(yù)后具有重要意義。

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(本文編輯：周駿)

(收稿日期：2015-05-20)

基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(H201047)

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.01.016