結腸腫瘤前細胞系的建立及應用

曹海龍　許夢雀　鄢　芳　王邦茂

300052　天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科

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·綜述·

結腸腫瘤前細胞系的建立及應用

曹海龍許夢雀鄢芳王邦茂

300052天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科

摘要：結腸腫瘤前細胞即永生化結腸上皮細胞系(IMCE)，來源于Immorto小鼠和腺瘤性結腸息肉病基因(Apc)(min/+)小鼠雜交后子代小鼠的結腸上皮細胞，其表型正常，可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，已成為腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展相關研究較為理想的細胞模型。此文主要就該細胞系的建立及其在腸道腫瘤發(fā)生機制和篩選防治藥物等領域中的應用進展作一綜述。

關鍵詞：結直腸癌；結腸腫瘤前細胞；腺瘤性結腸息肉病基因

近年來，結直腸癌(CRC)的發(fā)病率明顯增加?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)與CRC發(fā)生密切相關的一些重要的基因突變，如腺瘤性結腸息肉病基因(Apc)、K-ras、p53以及錯配修飾基因等[1]。目前仍有必要探討這些基因突變?nèi)绾斡绊懻＝Y腸上皮細胞的表型，含有基因突變的腫瘤前細胞如何發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，以及闡明已知CRC中發(fā)生變化的分子之間協(xié)同作用等。由于體外分化的人正常結腸上皮細胞的培養(yǎng)非常困難，目前國內(nèi)外研究仍多以結腸癌細胞作為相關研究模型[2-3]，顯然這些腫瘤細胞并不完全符合上述研究要求。結腸腫瘤前細胞即永生化結腸上皮細胞系(IMCE)，來源于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠雜交后子代小鼠的結腸上皮細胞，其表型正常，可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，已成為腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展相關研究較為理想的細胞模型[4]。本文主要就該細胞系的建立及其應用進展作一綜述。

1結腸腫瘤前細胞系的建立

1.1Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠

Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠的建立為結腸腫瘤前細胞系的建立提供了可能。Immorto小鼠攜帶了一種溫度敏感的猴病毒40(SV40)大T抗原基因(tsA58)的突變形式，使之可置于干擾素-γ(IFN-γ)誘導的H-2Kb啟動子(H-2Kb-tsA58)控制下。此外，研究表明80%以上散發(fā)性CRC存在Apc基因突變，家族性腺瘤性息肉病(FAP)的發(fā)生則主要與Apc基因突變有關[5]。Apcmin/+小鼠是由C57BL/6J雄性小鼠接受突變劑處理后與雌性小鼠 AKR/J 雜交，子代小鼠由于Apc基因兩條鏈中一條鏈的第850號密碼子發(fā)生無義突變，編碼亮氨酸的密碼子(TTG)轉(zhuǎn)變成終止密碼子(TAG)，形成截短APC蛋白，導致β-連環(huán)蛋白(β-catenin)不能降解，下游靶基因激活，可自發(fā)形成腸道多發(fā)腺瘤性息肉，是研究腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典動物模型[6-8]。

1.2結腸腫瘤前細胞系的特征

隨著Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠的建立，有學者在此基礎上逐步建立了IMCE細胞系[4,9]。由于IMCE細胞系來自于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠雜交后子代小鼠結腸上皮，因此同時攜帶一個Apc突變基因和SV40大T抗原基因；而用來源于年輕成年Immorto小鼠結腸上皮建立的細胞系被稱之為YAMC細胞系，它與IMCE細胞系最大的區(qū)別在于并不攜帶Apc突變，成為良好的實驗對照所需的正常細胞系。SV40大T抗原基因是與p53結合并抑制其在衰老方面作用的一種永生化基因，在允許溫度條件下(33℃)，SV40大T抗原基因產(chǎn)物以一種活性形式與p53結合，促進細胞永生。而在非允許溫度條件下(37℃～39℃)，基因產(chǎn)物的形式發(fā)生改變，不能結合p53使細胞永生。有學者將YAMC、IMCE及結腸癌細胞在分子遺傳學、形態(tài)學及表型等方面進行了比較，見表1[9]。

表1　YAMC、IMCE細胞系及結腸癌細胞生物學特性的區(qū)別

注：iNOS為誘導型一氧化氮合成酶，COX-2為環(huán)氧合酶-2

2結腸腫瘤前細胞系的應用

2.1研究結腸上皮細胞功能及其癌變機制

YAMC細胞(Apc+/+)和IMCE細胞(Apcmin/+)作為一種正常結腸上皮細胞和腫瘤前細胞模型已被用于多種細胞生物學功能的實驗研究：(1)用于結腸上皮細胞增殖和凋亡調(diào)控以及黏蛋白分泌的研究[10-13]；(2)研究誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)及β-catenin等關鍵分子的調(diào)控[14]；(3)探討各種生長因子對結腸上皮細胞遷移的作用[15]；(4)用于炎癥性腸病及腸道腫瘤癌變過程中發(fā)生變化的一些重要基因如K-ras[16]、β-catenin[14]、Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子5(KLF5)[17]等作用的探討。以下是應用的研究。

KLF與細胞生長調(diào)控和癌變有關。研究發(fā)現(xiàn)，IMCE細胞中表達的KLF5能夠增加克隆形成、細胞周期蛋白cyclinD1的轉(zhuǎn)錄及細胞生長，但在結腸癌細胞系中KLF5能減少克隆數(shù)量，并與細胞生長呈負相關；而將Ras基因轉(zhuǎn)染IMCE細胞后則發(fā)現(xiàn)KLF5水平下調(diào)。同樣，在Apcmin/+小鼠和FAP患者腸道腫瘤中KLF5 mRNA也顯著下降，這些結果提示KLF5的下調(diào)可能是腸道癌變過程中的早期分子事件[17]。

瘦素是一種來源于脂肪細胞的細胞因子，與肥胖和腸道炎性反應有關。有學者用YAMC和IMCE細胞系進行研究發(fā)現(xiàn)，瘦素可通過誘導天冬氨酸特異性半胱胺酸蛋白酶(caspase)的活性和凋亡途徑使YAMC細胞增殖顯著下降；而對IMCE細胞則表現(xiàn)為誘導細胞增殖，與胰島素樣生長因子(IGF)的作用類似，瘦素與IGF聯(lián)合應用可使增殖水平更高，主要涉及的機制是激活p42/44絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p38 MAPK以及促進核因子-κB(NF-κB)的核轉(zhuǎn)位[18]。他們進一步開展了瘦素誘導結腸上皮細胞產(chǎn)生促進血管生成的因子從而促進腫瘤進展方面的研究，結果發(fā)現(xiàn)瘦素僅在IMCE細胞中呈劑量依賴性誘導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)合成，用50 ng/mL瘦素處理IMCE細胞可顯著誘導毛細血管形成，VEGF的中和抗體能阻斷這一過程[19]。這些研究可能為肥胖相關性CRC的發(fā)生提供新的依據(jù)和潛在的治療靶點。

2.2闡明結腸癌變過程中相關分子間的協(xié)同作用

YAMC細胞和IMCE細胞還可用于研究結腸癌變過程中相關分子間的協(xié)同作用，以下是應用的研究。

2.2.1Apc基因和Ras基因如前所述，由于YAMC和IMCE細胞系均是表型正常的結腸上皮細胞系，可通過表達一種溫度敏感SV40大T抗原而有條件地無限增殖。在允許條件下(33℃，加IFN-γ)，YAMC和IMCE細胞系均不能在軟瓊脂上生長，不能在裸鼠上成瘤。D′Abaco等[16]使用這兩種細胞系探討了一種活化的V-Ha-Ras基因?qū)δ[瘤進展的影響，當SV40大T抗原失活時(39℃，不加IFN-γ)，細胞增殖停止；使用攜帶V-Ha-Ras基因的病毒分別轉(zhuǎn)染細胞，衍生出過度表達V-Ha-Ras基因的細胞系(YAMC-Ras和IMCE-Ras)，與親代細胞不同的是，在SV40大T抗原失活的條件下，YAMC-Ras和IMCE-Ras細胞仍均能繼續(xù)增殖并在軟瓊脂上形成克隆，IMCE-Ras細胞在3周之內(nèi)即可導致裸鼠成瘤，而YAMC-Ras細胞需要90 d方可誘發(fā)裸鼠成瘤。因此，該研究顯示Apc基因缺陷和Ras基因活化能協(xié)同促使正常結腸上皮細胞惡變。

2.2.2Apc基因和Src基因有研究應用IMCE細胞系證實，癌基因Src活性升高聯(lián)合Apc功能的部分缺失可導致結腸腫瘤的發(fā)生。在允許生長的條件下，通過p53的失活，細胞能夠永生化；不論Apc或p53的狀態(tài)如何，Src的表達能導致與細胞-細胞間連接缺失相關的形態(tài)學轉(zhuǎn)變、細胞骨架破壞以及獲得侵襲性。攜帶Apc突變的IMCE細胞表現(xiàn)出Src-介導的錨定非依賴性增殖能力較YAMC細胞更強，β-catenin蛋白水平和轉(zhuǎn)錄活性更高，而選擇性Src抑制劑能阻斷細胞侵襲和錨定非依賴性增殖[20]。

有研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒插入誘變技術探討細胞骨架相關基因在結腸癌變過程中的作用。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染后僅在IMCE細胞誘導錨定非依賴性轉(zhuǎn)化克隆形成，而在YAMC細胞并不形成克隆。進而在101個獨立的轉(zhuǎn)化體中確定了157個逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點，發(fā)現(xiàn)包括Dnah3、Ahnak、Stk17b和Rbm9等4個尋常整合位點。由于病毒整合，Dnah3和Ahnak上調(diào)，Dnah3發(fā)生截短，而且過表達Dnah3的IMCE細胞出現(xiàn)微管功能的受損。這些結果表明結腸癌變早期Apc基因相關的腫瘤進展過程中細胞骨架功能相關基因也起到重要作用[21]。

2.3篩選CRC及FAP化學防治的藥物

YAMC和IMCE細胞系模型作為正常結腸上皮細胞和腫瘤前細胞還可用于篩選CRC及FAP化學防治的藥物，而且可以根據(jù)藥物對不同細胞系的作用不同，判斷藥物作用的階段是正常細胞向腫瘤前狀態(tài)轉(zhuǎn)化過程還是腫瘤的進展過程，為進一步的體內(nèi)研究及臨床試驗提供一些參考依據(jù)[9]。目前，應用這些細胞系已篩選出黃酮類化合物、姜黃素和小檗堿等潛在的防治藥物。

2.3.1黃酮類化合物有研究應用這兩種Apc基因不同的細胞系評價不同黃酮類化合物誘導細胞遷移的程度，并與肝細胞生長因子(HGF)誘導遷移進行比較，發(fā)現(xiàn)柑桔素和陳皮素不能誘導細胞遷移，但糖基化的這些黃酮類化合物卻能對YAMC和IMCE細胞顯示出不同的遷移性，表現(xiàn)為在低濃度下即可誘導IMCE細胞遷移，而對YAMC細胞并無作用，應用基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑證實這種作用依賴于MMP活性。因此，糖基化的黃酮類化合物對腫瘤前細胞遷移表型的誘導可能是CRC防治的一個新機制[22]。

2.3.2姜黃素Fenton等[15]分別給予YAMC和IMCE細胞系一定濃度的姜黃素、表皮生長因子(EGF)及HGF，發(fā)現(xiàn)給予EGF和HGF 24 h后，YAMC細胞較IMCE細胞具有更大的遷移反應，姜黃素組IMCE細胞較YAMC細胞反而具有更大的遷移反應；還發(fā)現(xiàn)EGF和HGF誘導細胞遷移依賴Apc基因和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)活性，而姜黃素誘導遷移并不依賴Apc。

2.3.3小檗堿筆者從美國Vanderbilt大學引入該細胞系，在國內(nèi)率先開展相關研究，發(fā)現(xiàn)小檗堿可劑量依賴性抑制IMCE細胞的增殖，促進細胞凋亡，這種作用可能與抑制表皮生長因子受體(EGFR)和蛋白激酶B的磷酸化有關[23]。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿促進IMCE細胞凋亡的機制為caspase非依賴途徑，可能通過刺激活性氧的產(chǎn)生進而引起組織蛋白酶B的釋放和多腺苷二磷酸多聚酶激活，最終引起凋亡誘導因子活化，而對YAMC細胞并無此效應。小檗堿還能刺激IMCE細胞泛素連接酶Cbl活化、促進Cbl和EGFR的相互作用以及EGFR泛素化下調(diào)，從而抑制細胞增殖，敲除Cbl能阻斷小檗堿下調(diào)EGFR及抑制細胞增殖的作用[25]。由于IMCE細胞是一種表型正常的結腸腫瘤前細胞，因此小檗堿可能在早期階段即能發(fā)揮防治腫瘤的作用。

3存在的問題及展望

結腸腫瘤前細胞系也存在一些局限性，如IMCE來源于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠雜交的子代小鼠的結腸上皮，但后者息肉主要出現(xiàn)在小腸，結腸息肉較少，與結腸腫瘤和FAP患者的息肉主要發(fā)生在結腸并不一致；YAMC仍不具備正常結腸上皮細胞的全部特性，如不能在細胞表面形成刷狀緣，僅能形成一些微絨毛。盡管如此，這些細胞系的建立使得培養(yǎng)正常結腸上皮細胞及腫瘤前細胞成為可能，近年來在腸道腫瘤防治的研究方面發(fā)揮了越來越重要的作用[4,9,26]。今后還需建立更為理想的細胞模型，為進一步深入研究結腸腫瘤的發(fā)病機制和化學防治奠定基礎。

參考文獻

1 Vasen HF, Tomlinson I, Castells A. Clinical management of hereditary colorectal cancer syndromes[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2015, 12: 88-97.

2 Herr R, K?hler M, Andrlová H, et al. B-Raf inhibitors induce epithelial differentiation in BRAF-mutant colorectal cancer cells[J]. Cancer Res, 2015, 75: 216-229.

3 王邦茂, 翟春穎, 方維麗, 等. 鹽酸小檗堿對脫氧膽酸誘導的HT-29人結腸癌細胞增殖的抑制作用及機制研究[J]. 中華消化雜志, 2006, 26: 749-752.

4 Whitehead RH, Robinson PS. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from the intestinal tissue of adult normal and transgenic mice[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2009, 296: G455-G460.

5 Syngal S, Brand RE, Church JM, et al. ACG clinical guideline: genetic testing and management of hereditary gastrointestinal cancer syndromes[J]. Am J Gastroenterol, 2015, 110: 223-262. 6 Cao H, Song S, Zhang H, et al. Chemopreventive effects of berberine on intestinal tumor development in Apcmin/+mice[J]. BMC Gastroenterol, 2013, 13: 163.

7 Guo H, Nagy T, Pierce M. Post-translational glycoprotein modifications regulate colon cancer stem cells and colon adenoma progression in Apcmin/+mice through altered Wnt receptor signaling[J]. J Biol Chem, 2014, 289: 31534-31549.

8 Zhang N, Subbaramaiah K, Yantiss RK, et al. Id1 deficiency protects against tumor formation in Apcmin/+mice but not in a mouse model of colitis-associated colon cancer[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2015, 8: 303-311.

9 Fenton JI, Hord NG. Stage matters: choosing relevant model systems to address hypotheses in diet and cancer chemoprevention research[J]. Carcinogenesis, 2006, 27: 893-902.10 Hobbs SS, Goettel JA, Liang D, et al. TNF transactivation of EGFR stimulates cytoprotective COX-2 expression in gastrointestinal epithelial cells[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2011, 301: G220-G229.

11 Yang R, Bie W, Haegebarth A, et al. Differential regulation of D-type cyclins in the mouse intestine[J]. Cell Cycle, 2006, 5: 180-183.

12 Yamaoka T, Yan F, Cao H, et al.Transactivation of EGF receptor and ErbB2 protects intestinal epithelial cells from TNF-induced apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105: 11772-1177.

13 Wang L, Cao H, Liu L, et al. Activation of epidermal growth factor receptor mediates mucin production stimulated by p40, a Lactobacillus rhamnosus GG-derived protein[J]. J Biol Chem, 2014, 289: 20234-20244.

14 Wagenaar RA, Crawford HC, Matrisian LM. Stabilized beta-catenin immortalizes colonic epithelial cells[J]. Cancer Res, 2001, 61: 2097-2104.

15 Fenton JI, Wolff MS, Orth MW, et al. Membrane-type matrix metalloproteinases mediate curcumin-induced cell migration in non-tumorigenic colon epithelial cells differing in Apc genotype[J]. Carcinogenesis, 2002, 23: 1065-1070.

16 D′Abaco GM, Whitehead RH, Burgess AW. Synergy between Apc min and an activated ras mutation is sufficient to induce colon carcinomas[J]. Mol Cell Biol, 1996,16: 884-891.

17 Bateman NW, Tan D, Pestell RG, et al.Intestinal tumor progression is associated with altered function of KLF5[J]. J Biol Chem, 2004, 279: 12093-12101.

18 Fenton JI, Hord NG, Lavigne JA, et al. Leptin, insulin-like growth factor-1, and insulin-like growth factor-2 are mitogens in Apcmin/+but not Apc+/+colonic epithelial cell lines[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005, 14: 1646-1652.

19 Birmingham JM, Busik JV, Hansen-Smith FM, et al. Novel mechanism for obesity-induced colon cancer progression[J]. Carcinogenesis, 2009, 30: 690-697.

20 Tanaka M, Jin G, Yamazaki Y, et al. Identification of candidate cooperative genes of the Apc mutation in transformation of the colon epithelial cell by retroviral insertional mutagenesis[J]. Cancer Sci, 2008, 99: 979-985.

21 Constancio-Lund SS, Brabek J, Hanks SK. Src transformation of colonic epithelial cells: enhanced anchorage-independent growth in an Apc+/minbackground[J]. Mol Carcinog, 2009, 48: 156-166.

22 Fenton JI, Hord NG. Flavonoids promote cell migration in nontumorigenic colon epithelial cells differing in Apc genotype: implications of matrix metalloproteinase activity[J]. Nutr Cancer, 2004, 48: 182-188.

23 曹海龍, 王邦茂, 鄢芳, 等. 小檗堿對永生化結腸細胞系生長的影響及其機制[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2011, 50: 420-423.

24 Wang L, Liu L, Shi Y, et al. Berberine induces caspase-independent cell death in colon tumor cells through activation of apoptosis-inducing factor[J]. PLoS One, 2012, 7: e36418.

25 Wang L, Cao H, Lu N, et al. Berberine inhibits proliferation and down-regulates epidermal growth factor receptor through activation of Cbl in colon tumor cells[J]. PLoS One, 2013, 8: e56666.

26 Franklin JL, Rankin CR, Levy S, et al. Malignant transformation of colonic epithelial cells by a colon-derived long noncoding RNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 440: 99-104.

(本文編輯：林磊)

(收稿日期：2015-03-23)

通信作者：王邦茂，tjmughgi@hotmail.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81300272，81470796)，高等學校博士學科點專項科研基金(20121202110018)，天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(13JCQNJC10600)

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.01.006